主题：【第十五届原创】光谱滴定技术替代感官滴定方法在淀粉加工产品二氧化硫测量的研究

光谱滴定技术在淀粉加工产品二氧化硫测量的讨论

4、测量原理：

吸收液中加入甲基红为指示剂，滴加碱液后，氢离子浓度变化引起甲基红结构的改变，致使吸收光谱发生了改变，伴随甲基红结构改变引起溶液的吸收光谱随之发生迅速的而改变，此时被认为是滴定终点，根据滴定终点所消耗氢氧化钠标准溶液的体积量，计算试样中二氧化硫的含量。

4.1、人工滴定测量原理：

人眼睛/传感器接收后，大脑呈现/复原呈颜色。滴定终点为颜色突变点。

4.2、VSTT技术测量原理：

VSTT方法采用同步光谱测量技术还原光谱成分呈现的颜色变化，建立与试剂量关联的色变曲线，以曲线上的信号峰标识滴定终点，实现了分析过程中不依赖人感官感觉的数字化、图形化、可溯源测量技术。

5、二氧化硫含量计算公式

计算公式：

式中：

X——试样中二氧化硫含量（以SO₂计），单位为毫克每千克（mg/kg）

V——试样溶液消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；

V₀——空白溶液消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；

c——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；

0.032——1 mL浓度为1 mol/L的氢氧化钠标准溶液相当于二氧化硫的质量（g），单位为每毫摩尔（g/mmol）；

m—试样质量，单位为克（g）；

同时做空白。

6、使用的器材、仪器、试剂

光谱滴定仪：SXZ-3型，秦皇岛水熊科技有限公司生产。配备8位自动进样器，光纤光谱仪，400 μm 光纤,AST905接口，配准直透镜，数控搅拌器，自动信号处理系统；光谱范围380 nm～780 nm，△λ5 nm，测量周期200ms，积分时间150 ms，光程10.0 mm，S_快+S_慢滴定模式，滴定速率0.167 ml/min，搅拌速度400转/min，180 mL靴型反应器。
反应器：150 mL，靴型，石英材质，L=10.0mm, 秦皇岛水熊科技有限公司生产。
器材：按照国家标准《GB/T 5009.1-2003食品卫生检验方法  理化部分  总则》中7的规定，使用的滴定管、移液管、容量瓶、可图吸管、比色管玻璃量器经按照国家有关规定及规程进行校正，并在有效期内；使用的温度控制设备、测量仪器，均按照按照国家有关规程进行了测试和检定校正。
试剂：按照《GB/T 5009.1-2003食品卫生检验方法理化部分 总则》、《GBT 601-2016  化学试剂标准滴定溶液的制备》、和待比对的标准方法中规定的要求制备。

3%过氧化氢溶液（临用时现配）；

盐酸溶液（1+1）；

甲基红乙醇溶液指示剂（2.5 g/L）；

0.01 mol/L氢氧化钠标准溶液，按照GB/T601配制0.1 mol/L并标定，临用时，用无二氧化碳的水稀释至0.01 mol/L。

7、参加验证人员
******
8、方法学内容：
VSTT与人工感官滴定结果t检验与VSTT滴定参数的选择、检出限、定量限、精密度、准确度、适用范围

9、验证内容与数据
9.1、甲基红性质与变色阈
    甲基红（Methyl Red），CAS号493-52-7，分子式C₁₅H₁₅N₃O₂，结构式见图1。变色域值为pH4.5～pH6.2（红→黄）。甲基红在不同pH环境下的的结构变化见图2。图2中显示，在不同的pH环境下，甲基红有不同的分子结构，这就导致其吸收的光谱成分也不同，在其结构改变的临界点，吸收光谱也随之发生变化，该变化点即为滴定终点。

图1.甲基红的化学结构式平面示意图

图2.甲基红在不同条件下的结构变化

9.2、甲基红变色曲线
    在传统资料中，甲基红变色域值为pH4.5～pH6.2（红→黄），没有清晰的pH变色值。采用VSTT技术对甲基红进行测量，可以建立颜色变化曲线，见图3。

图3.甲基红CIE 1976 (L^*a^*b^*)的滴定参数曲线平面坐标图

9.3、VSTT确定滴定终点

VSTT同时还可以建立滴定曲线，见图4。从图4中可以的看到，可以利用VSTT技术，确定含有甲基红为指示剂的滴定终点。

图4.甲基红的VSTT滴定曲线与滴定终点

9.4、VSTT不同参数的不同滴定终点
    VSTT可以提供许多色变曲线参数，不同的参数对应与不同的滴定终点，见图5。与标准方法或者标准物质进行比对后，选择结果有较好吻合性的参数为测量用参数。

图5. VSTT不同参数的出峰顺序

（S_Ja*-C、S_Jb*-△E、S_Jb*-h*、S_Ja*-b*、S_Ja*-△E、S_Jh*-△E、S_Ja*-h*、S_Jb*-C）

9.5、VSTT与人工感官滴定结果t检验与VSTT滴定参数的选择
    使用相同样品，用不同方法进行测量，然后比较二种方法在统计学上的差异。

表1. VSTT与人工感官滴定结果                                  

从表1中数据分析，VSTT的S_Jb*-C_ab参数和S_JCab-h^*_ab参数的测量结果与人工方法没有明显区别。

分别对人工感官滴定和VSTT的不同参数结果，用SPSS22.0软件进行配对样本t检验分析，验证VSTT参数结果与人工感官滴定结果是否有统计学上的显著性差异。见表2。

表2. VSTT与人工感官滴定结果t检验

注1：上限和下限均指95%差异数的置信区间。

注2：N=6；自由度df=5。表2的t检验结果显示，VSTT法参数S_Jb*-C_ab与人工感官滴定结果在统计学上均无显著性差异(P＞0.05)。后期实验选择该参数为实验用参数。

9.6、干扰条件
1、甲基红指示剂的空白影响

表3. 空白样品消耗氢氧化钠标准溶液

Table 3. Blank sample consumption of sodium hydroxide standardsolution

表2参数表明，0.243 mL的0.001954 mol/L氢氧化钠标准溶液与0.01 mol/L氢氧化钠标准溶液47.5  μL的氢氧化钠质量相当。但VSTT慢速滴定模式将滴定过程分为120步（滴）左右，比人工滴定低2个数量级，可以建立滴定过程的VSTT色变曲线，用色变峰标识空白的滴定终点，方便进行指示剂等少量加入试剂的精确测量研究。

2、滴定试剂脉动加入与搅拌速度的影响
限制于试剂加入控制技术的滞后，由于滴定分析中反应试剂的加入是不连续的脉动式加入，不可避免的在加入——停顿——加入过程中产生相对于整体反应体系的局部试剂浓度梯度，在搅拌混匀中伴随浓度梯度的不断改变，形成局部的浓度过高（过滴定终点，局部颜色变色）——浓度稀释（未到滴定终点，局部颜色变浅）——浓度继续稀释（局部颜色变浅甚至消失）的现象，我们叫这种现象为试剂梯度扩散引起的色团羽流，见图6。
色团羽流是引起VSTT的色变曲线脉动的主要影响因素。该现象与搅拌条件[搅拌速度、搅拌桨形状、被滴定液体性质（包括浓度、稠度、起泡性、液面高度，等）浓度、滴定试剂加入速度、指示剂色变指数，等]密切相关。限于科研条件，无法进一步详细研究。
根据经验，本次实验的搅拌速度在350 rpm～450 rpm为佳。

图6. 试剂脉动加入的梯度扩散与色团羽流

3、反应器固定的牢固程度效果评价

以光路中反应器固定的牢固程度对测量结果的影响验证实验过程中光路固定效果对测量结果的影响程度。在反应器位置非固定和固定的条件下分别进行测量，进行滴定终点重复性测量，分析测量结果的变化，确定反应容器固定的牢固程度是否对测量结果有影响。

在实验过程中，反应器位置是否固定的条件下测定粉丝样品中二氧化硫含量结果见表4。

表4.反应器位置是否固定对测量结果的影响

表5. 降噪处理对测量结果的影响

图7. 卡尔曼处理数据的色度值参数效果（L^*）

图8. 卡尔曼处理数据的色度值参数效果（a^*）

图9. 卡尔曼处理数据的色度值参数效果（b^*）

由于滴定方法没有明确的检出限方法，本案例参考采用采用基质含量低的样液，测定重复平行试验，测定结果按HJ168—2020 环境监测分析方法标准制订技术导则的滴定方法的检出限计算公式，计算粉丝的二氧化硫检出限。

制作已知含量的基质样液，稀释不同系列浓度的样液进行测量，直至出现最小可辨认信号峰的含量。实际测量的样液VSTT参数S_Jb*-C最小含量为0.1914 mg/kg，信号值峰高4×10⁶，突变峰与基线分离非常好，测量数据见表6，色变曲线见图10。质量控制图见图11。

图10.VSTT参数S_Jb*-C的色变曲线

图11.重复37次平行试验的质量控制图


方法检出限计算公式：MDL=t_(n-1，0.99)×S……（2）。式中：MDL—方法检出限；n——样品的平行测定次数；t——自由度为n-1，置信度为99%时的t分布值（单侧）；S——n次平行测定的标准偏差。

表6. 粉丝的二氧化硫检出限

本次测定t_(10，0.99)值为2.434，以此计算本方法的VSTT检出限为1.32 mg/kg。其中，SO₂质量检出限质量为0.020 mg，低于国标GB5009.34中的检出限质量0.035 mg。

9.9、方法定量限

从图10中VSTT参数S_Jb*-C的色变曲线的信号值与基线值之间的分离程度非常好，其信号分辨的可信性好，本案例采用约3倍的检出限为定量限，确定定量限为4 mg/kg。

9.10、精密度

按定量限4 mg/kg，进行VSTT方法的定量限的1.0倍、1.5倍、2.0倍的添加水平实验，结果见表7。

表7.精密度检验(n=6)

表7数据说明，定量限的1.0倍、1.5倍、2.0倍的添加实验，依次为平均值8.08 mg/kg、10.1 mg/kg和12.1 mg/kg，回收率95.5%～107.9%、98.6%～104.2%和90.7%～108.6%，RSD为2.1%、1.25%和7.2%，均满足要求。

9.11、准确度（准确度）

测定值与真值相符的程度。用于表述无穷多次重复测定结果的平均值与参考值之间的接近程度，正确度差意味着存在系统误差，通常用偏倚表示。而测量结果的偏倚则通过回收率实验进行评估。



回收实验用于评估偏倚，可通过计算回收率来进行评价。在偏倚测试中，测定值与参考值会有重大的偏离。最理想的偏倚评估是利用样品的基质匹配且浓度相近的有证标准物质（CRMs）进行测试，但是，实际上找不到含有二氧化硫成分的粉丝标准物质。所以，用可替代的物质来评定偏倚。本案例采用采用分析参考物质（RM）亚硫酸钠来评估回收率，即：将已知浓度的分析物加到样品中，按照预定的分析方法进行检测，测得的实际浓度减去原先未添加分析物时样品的浓度，并除以所添加浓度的百分率。

回收率（P）可通过公式（3）计算：P=[(X₁-X₀)/m]×100……（3）。式中：P——加入的亚硫酸钠标准物质的回收率；m——加入的亚硫酸钠标准物质的量；X₁——加入的亚硫酸钠标准物质的试样的测定值；X₂——未加入的亚硫酸钠标准物质的试样的测定值。

    添加低、中、高不同浓度标准溶液的样品，进行回收率实验，结果见表8。

表8.不同浓度的样品回收率实验

表8数据说明，VSTT法在添加浓度范围为20 mg/kg～100 mg/kg范围内的回收率为92.7%～109.5%，RSD为1.8%～4.6%。满足浓度水平范围在1～100时，回收率范围90～100%和＞100mg/kg时，回收率范围95～105%的技术要求。

9.12、线性范围
    按照粉丝的限量要求为30 mg/kg。表7的定量限4 mg/kg添加和表8的高浓度添加的回收率说明，在4 mg/kg～100 mg/kg范围内，回收率为90.7%～109.5%，符合技术要求、满足实际需要。

9.13、适用范围
对不同原料品种的粉丝分别进行了人工感官方法与VSTT方法的中间精密度实验，见表9。

表9. 不同原料品种的粉丝的不同方法比较

表9结果表明，VSTT法参数的中间精密度的RSD%为1.62%～2.02%，人工感官滴定的1.79%～3.38%。

10、结论：

VSTT方法检测粉丝中二氧化硫残留量，与国标的人工方法没有差异，其它方法学参数符合国家标准要求。MDL1.3mg/kg，SO₂检出限质量为0.02 mg；定量限1倍、1.5倍、2倍添加回收率为95.5%～108.6%、RSD1.25%～7.2%，中间精密度RSD%1.62%～2.02%；准确度添加回收率95.5%～109.8%，RSD1.25%～2.34%。

明显的优点是，遵循吸收光谱变化确定滴定终点的技术路线，建立的VSTT方法的S_Jb*-C色变曲线，终点峰值明显，操作方法简单，与人工感官滴定相比有明显的优势，实现滴定自动化、测量结果数字化、滴定终点图形化，克服人工感官滴定方法的色评价条件影响、避免人色观察阈值不一致、语言描述理解困难和无法量值溯源的痼疾，可替代、克服中颜色终点判断缺陷，实现滴定分析颜色判定终点方法的数字化、曲线化、量值可溯源。



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