主题：【资料】杂交瘤技术原理及优缺点介绍

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发表于：2023/08/24 15:59:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

杂交瘤技术是指建立杂交瘤细胞系的技术，其用于产生大量单克隆抗体，所以又称单克隆抗体技术。其是在细胞融合技术上发展起来的：将B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌免疫蛋白的杂交瘤细胞。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原结合位点的抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能识别一种特定的抗原决定簇。正是由于其特异性强，因此被广泛应用于生物学，药学，医学等领域，具有极其远大的应用前景，因此用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要。

杂交瘤技术原理：

杂交瘤技术基于三种关键技术。

一、动物免疫

将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的B淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的B淋巴细胞大量增殖。

二、细胞融合

B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡-短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。

通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（PEG），物理方法如电融合。

B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞-脾细胞融合体，骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞融合体，脾细胞-骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术-杂交瘤细胞筛选-将所需的杂交瘤细胞分离出来。

三、杂交瘤细胞筛选

筛选杂交瘤细胞一般使用HAT培养基。

HAT培养基筛选方法基本原理：

HAT培养基成分：含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。

细胞DNA合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase， HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase，TK)将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成原料。

HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）基因，使得它们对HAT培养基敏感，阻断了DNA补救合成途径。

将融合的细胞在HAT培养基中孵育大约10至14天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为HAT培养基阻断了骨髓瘤细胞两大DNA合成途径。未融合的以及自身融合的B淋巴细胞虽然能够合成HGPRT酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在HAT养基中，只有B细胞-骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（B细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。

然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的B细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。

接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。

杂交瘤技术的优缺点介绍：

1、优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。

2、缺点：

a.操作步骤繁琐。

b.利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(HAMA）反应、在人体循环系统中很快被清除等。

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