主题：【资料】抗体开发过程中的常见问题及解决方案详解

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发表于：2023/10/12 15:40:48 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

问题一：应如何确定选择单抗还是多抗定制？

多抗是多个B细胞克隆产生的针对多种抗原表位的多种抗体混合物，单抗是一个B细胞克隆产生的针对一种抗原表位的的单一抗体。

对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多。例如，WB/IP/IF/ICC等，一般选择单抗。对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA检测，一般选择多抗。

问题二：WB，IHC，IP/ChIP类型抗体有什么区别？

WB：目前最常做的类型，WB识别的蛋白是经过加热变性之后都变成线性结构的蛋白。

IHC：免疫组化中需要进行固定一步，固定是为了尽量让细胞的形态结构维持和原有的一致。这种化学物质的固定使蛋白质变性凝固，与天然状态下的蛋白质有了一定的区别，但是又不同WB中加热变性变成了线性的结构。

IP/ChIP：这类实验是用抗体去结合生理状态下的蛋白质，因此IP和ChIP的抗体最好使用纯化的天然蛋白制作的抗体。

问题三：多抗做WB检测为何有杂带？

1) 从纯化方式来看：采用ProteinA/G纯化的多抗掺杂有动物本身产生的对其自身抗原产生的抗体，这些抗体在检测中会识别样本中的蛋白而出现杂带，可以采用抗原亲和纯化避免杂带的产生。

2) 从蛋白修饰来看：天然蛋白存在复杂的翻译后修饰。这点可以通过信息学分析进行解释。

3) 从蛋白翻译后加工来看：翻译后蛋白前体经切割可能会使部分蛋白分子量偏小，而天然组织中同时存在蛋白前体和切割加工后的蛋白，二者序列有相同部分，可能会产生杂带。这点需要通过查阅与目的蛋白相关文献进行了解。

4) 从同源家族蛋白来看：当目的蛋白有同源家族蛋白时，蛋白异构体的存在可能会使分子量偏离预测分子量，因为天然样本中由同一个mRNA不同的剪接方式进行翻译形成的蛋白产物也会有相同的抗原表位，同时被抗体识别时会产生杂带。

5) 从蛋白聚集形式来看：蛋白多聚体的形成，虽然还原条件可以抑制多聚体的形成，但是强烈的蛋白间相互作用在还原条件下也有可能不解聚导致条带偏大。

Q：抗体做WB为何不识别内源样本？

1) 蛋白在天然样本中的丰度太低，此时需要进行富集或者过表达再进行检测。

2) 如果丰度不低，单抗/多抗不识别内源可能是该抗体识别的表位在天然蛋白中有修饰位点，此时需要对蛋白进行修饰位点的分析。

问题四：为什么小分子量蛋白质考染和WB条带大小与预期的不同？

蛋白质印迹是根据大小分离蛋白质的技术。通常，分子量越小的蛋白质在凝胶中的迁移速率越快。但是迁移速率也受其他因素影响，因此观察到的实际条带大小与预期的可能会有差别。

常见因素包括：

翻译后修饰：例如磷酸化、糖基化等，这些修饰会增加蛋白质的分子量。

翻译后剪切：例如，很多蛋白质首先合成为前体蛋白，然后剪切形成活性形式，例如半胱天冬酶前体

剪接变体：通过选择性剪接，可实现同一基因产生不同大小的蛋白质

相对电荷：氨基酸的组成（带电荷的氨基酸与未带电荷的氨基酸各自所占的比例）

多聚体：例如，蛋白质二聚体。蛋白之间强烈的相互作用会造成条带偏大，但采用还原条件通常可以避免多聚体的形成。

问题五：我应使用什么浓度的一抗？

结题报告中有推荐的使用浓度，但是鉴于操作平台及试剂体系均有差异，建议客户结合自己的实验平台再做测试，以达到最佳的使用效果。

问题六：我应如何选择合适的二抗？

二抗应抗所用一抗的宿主物种。例如，如果一抗是小鼠单克隆抗体，则需要抗小鼠的二抗。我们建议您核查二抗的数据表，确保该二抗在您即将采用的应用中是测试过的。

七：我应如何保存抗体？

我们建议始终按照数据表上的方法保存抗体。如果没有按照数据表上的说明保存，我们不能保证抗体的性能。

八：我应如何分装抗体？

最好可以根据一次实验的常用量进行分装。如果一周内可完成实验，可分装出需要的抗体量，保存在4℃，如果实验周期较长，可添加50%甘油，保存在-20℃，剩余量分装后保存至-80℃，可保存2-3年。

九：我怎么判断一种抗体是否可以从某个未测试的物种中检测出？

不能保证抗体在未测试过的物种中的性能，即使序列比对值很高。决定抗体在其他物种中的结合性的变量有很多。

如果没有其他的选择，并且您觉得有必要考虑购买抗体用于未经测试的物种时，我们推荐您进行免疫原与关注蛋白质的序列比对。可以通过在线数据表上的Swiss-Prot蛋白质数据库链接查到序列。很多网站提供计算比对百分率的工具。

十：什么是克隆号？

克隆号是指定给单克隆杂交瘤细胞产生的抗体的编号，表用来制造该抗体的克隆自腹水的特定细胞系，所以每个克隆细胞系都有一个唯一的克隆号。

详情关注：抗体开发https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-developmen