主题：【资料】Protein A/G纯化抗体的原理及常见问题解析

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发表于：2023/12/13 16:16:06 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

ProteinA/G纯化技术是一种基于亲和层析的分离方法，它利用抗体与其百度文库定抗原之间的亲和力来实现纯化。该技术的原理是将抗体固定在亲和树脂上，然后将混合物通过亲和树脂柱，使抗原与抗体结合，从而实现抗原的纯化。

抗体纯化常见问题解析：

1、PROTEIN A ， PROTEIN G 和 PROTEIN L 对不同种属和抗体亚型的相对结合强度？

首先根据不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（如下图），Protein A和Protein G 均结合抗体的重链部分，若存在 Protein A 及 Protein G 都有较强结合能力时，更加推荐 Protein A。 Protein A 的洗脱条件（pH 3.5–4.5）较 Protein G（< pH 3）更加温和，利于对低 pH 敏感抗体的稳定性。另外， Protein A 有耐碱清洗的 PrismA或 SuRe 配基可供选择，且载量更高。尤其是纯化多个抗体，为了避免交叉污染，优先推荐耐碱清洗的填料，长久使用更经济。

Protein G Sepharose 来源于链球菌，为细胞表面的 III 型 Fc 受体。可以广泛、更强地结合更多类型的IgG、多克隆 IgG 及人 IgG。同时，重组表达的 Protein G 去除了 N 端白蛋白结合结构域，血清蛋白结合水平更低。此外，Protein G 还可以和某些抗体的 Fab 和 F (ab’)2 段结合。但是，其工业化程度低于 Protein A。

Protein L结合抗体的轻链可变区，适合抗体片段的纯化。同时Protein L对于某些种属亚型有结合能力，可以作为Protein A和Protein G的有效的补充。

2、不同类型的 PROTEIN A 配基，有什么差别，如何选择？

Nprotein A 即为天然 (Native) Protein A，来源于金黄色葡萄球菌。有5 个结合结构域可以和 IgG 的 Fc 区有强的特异性结合。

Rprotein A Sepharose 4 FF，为重组 Protein A，去除了天然蛋白中跟抗体结合不相关的细胞壁结合结构域，分子量从 42 KD 减少到 34 KD。主要结合 Fc 区。经基因工程改造后，单点定向偶联于琼脂糖骨架上，降低空间位阻，增加了与 IgG 的结合能力，载量比 nprotein A更高；同时重组的配基，在发酵和纯化过程中没有使用人源的IgG，避免了人源 IgG 的污染风险。

rmpProtein A，多位点附着的技术，保证更低的重组protein A配基的脱落。

MabSelect 为 rProtein A 配基，使用高流速琼脂糖凝胶基架 ( 类似 Capto，但孔径更大)。

MabSelect Xtra(rProtein A 配基)，比 MabSelect 粒径小、载量更高，孔径更大。

MabSelect SuRe 偶联了耐碱的 SuRe 配基，耐受 0.1~0.5 M NaOH。

MabSelect SuRe LX 相对于 MabSelect SuRe，增加了配基密度，载量提高30%。

3、抗体片段的纯化填料，如何选择？

不同配基结合特征如下：

rProtein A 和 PrismA 配基可以结合抗体 Fc 区域以及重链可变区VH3。

Protein G 配基除了与 IgG 的 Fc 区域特异性结合，还可以和某些抗体的 Fab 段结合。

Protein L 配基对于人 kappa I, III 和 IV 亚型以及小鼠的 K1 轻链有很强的亲合力，结合位点在 Kappa 轻链的可变区。

KappaSelect 层析介质与人 KappaFab ( 恒定区 ) 结合，以及LambdaFabSelect 层析介质与人 LambdaFab( 恒定区 ) 结合。

4、纳米抗体 VHH 的纯化，选择什么填料？

PrismA 填料，配基是改造的耐碱配基 PrismA，保留了与VH3 的结合能力，可以用于 VHH 的亲和捕获。耐 1M NaOH 和高载量，为首选。

rProtein A 的配基填料，包括 MabSelect、 MabSelect Xtra 和rProtein A。

注意： SuRe 配基，如 MabSelect SuRe 和 MabSelect SuRe LX 不行。 SuRe 配基是一个同型四聚体配基，避免了不同配基结构域与抗体Fc 段亲和性的差异，也消除了对某些 Fab 段的亲和作用，不能用于 Fab 区样品结合。

5、普通的 PROTEIN G 和 PROTEIN A SEPHAROSE 填料如何清洗？可以重复使用吗？

普通的 Protein G 和 Protein A 配基，不耐碱，清洗效果差，使用次数很有限。建议反向清洗：

对于沉淀或变性的蛋白：用 6M 盐酸胍清洗 2 个柱体积，立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗，反向冲洗，每次清洗时间不超过 10min。

对于去除疏水性的物质 ( 如疏水性蛋白、脂蛋白、脂质 )：使用非离子型去污剂，如 0.1% Triton X-100， 37 度孵育 1 min。立即用至少 5 个柱体积的无菌结合缓冲液清洗；或者 70% 乙醇浸泡12 小时左右，然后立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗。注意 70% 乙醇处理时，粘稠故压力大，需要降低流速。

义翘神州提供瞬时转染HEK293和CHO细胞培养物的重组抗体、来自杂交瘤培养物的小鼠、大鼠和兔单克隆抗体以及来自动物血清的多克隆抗体。我们的抗体纯化服务涵盖人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、犬（狗）抗体和牛抗体的所有亚型和类别（IgG、IgA和IgM）。通常，我们的抗体纯化服务与抗体生产和细胞培养服务相结合。以下是我们的抗体纯化部分清单：

? 具有单体纯度和内毒素控制的优质抗体纯化和精纯

? 人、小鼠、大鼠、兔和犬IgG抗体纯化服务

? 人和小鼠IgA抗体纯化服务

? 人和小鼠IgM抗体纯化服务

? 利用蛋白A/G亲和树脂法的克隆抗体纯化

? 利用抗原亲和树脂的多克隆抗体纯化

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