1）化学酶促标记-羟胺可逆富集O-GlcNAc糖肽新方法的确立

目前现有的非共价作用富集法的亲和力和特异性通常较低，难以提高O-GlcNAc鉴定的覆盖度；以化学酶促标记法为代表的共价作用富集策略，显著提高了糖肽富集的特异性，然而引入大质量标签会降低糖肽的鉴定效率，因此，发展O-GlcNAc糖肽的‘无损’成为其高特异性富集、高覆盖度鉴定的关键。

首先在标肽层次进行方法可行性的验证：选用三条带有O-GlcNAc修饰的肽段（SGP1：NNLEES(GlcNAc)LLKLE；SGP2：SVES(GlcNAc)GSVDVK；SGP3：TAPTS(GlcNAc)TIAPG）转接酮糖后与烯丙基羟胺、甲氧羟胺可逆反应，并采用硅胶键合烯丙基羟胺小分子的羟胺富集材料对带有酮羰基的O-GlcNAc糖肽在酸性条件下进行富集，MALDI数据显示转糖、富集以及释放均成功进行，实现了在标肽层次对O-GlcNAc糖肽的成功富集。

为验证该方法的特异性，在标肽层次按1：100/1：1000/1：10000的比例加入BSA，考察在BSA干扰情况下该方法的富集效果，MALDI数据显示在目标肽段与BSA比例在1：10000条件下，仍能特异性的富集到带有酮基糖肽，验证了方法的可行性及高特异性。

2）O-GlcNAc糖肽富集新方法在Hela细胞全肽层次验证

为验证该方法的普适性，在Hela细胞核肽及全肽层次进行实验，运用合成的带有烯丙基羟胺小分子的硅胶材料对生物样本中的O-GlcNAc糖肽进行富集，通过优化富集、洗涤条件提高方法的灵敏度、特异性和覆盖度，在复杂体系中实现对O-GlcNAc糖肽富集新方法的验证。

3）O-GlcNAc糖肽富集新方法在研究O-GlcNAc水平对相分离调控机制研究中的应用

相分离是近年来研究的热点，已有研究表明相分离在细胞中普遍存在，与基因组的组装、转录调控可能密切相关，相分离的失调可能是一些疾病（如神经/肌肉退行性疾病）发生的病因，相关领域的科学家也开始通过相分离这个视角重新审视相关疾病，通过干扰异常“相分离”来达到治疗相关疾病的目的。随着相分离的研究逐渐增多，研究人员发现相分离在无膜器官的形成，信号转导、细胞骨架、超分子组装、基因的激活等扮演着功能，相分离异常可能导致疾病，如神经退行性疾病、肿瘤、衰老等。关于糖基化水平与相分离关系的研究尚处于初步阶段，相分离与O-GlcNAc修饰之间的关系仍不明确，O-GlcNAc是否与相分离的调控有关，又是如何进行调控的仍需要简单快速高效的O-GlcNAc糖肽富集策略进行辅助研究。

本文尝试应用新开发的O-GlcNAc糖肽富集策略对相分离前后Hela细胞全蛋白的O-GlcNAc水平进行系统分析，通过比较差异蛋白研究O-GlcNAc修饰对相分离的影响，为解释相分离的本质提供基础。

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3-4.docx(未验证)