主题：【资料】蛋白分离纯化方法全解：最详尽的指南

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发表于：2023/10/27 16:08:35 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

不同的蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，从而导致其在物理、化学和生物学特性中存在差异。考虑到细胞提取物中重组蛋白的相对丰度较高，开发生产纯蛋白（SDS-PAGE显示单一条带）的实验室规模纯化方案应该相对简单。

下游处理方案中的各个步骤可分离混合物中的蛋白和非蛋白部分，最终将所需的蛋白与所有其他蛋白分离，同时保留多肽的生物活性和化学完整性。分离步骤会利用粗混合物中目标蛋白与其他蛋白之间的化学/结构/功能特性的差异。这些性质包括大小、形状、电荷、等电点、电荷分布、疏水性、溶解性、密度、配体结合亲和力、金属结合、可逆结合、翻译后修饰以及特定的序列或结构。下面是针对蛋白分离纯化方法做了以下汇总：

1.根据蛋白质溶解度的差别分离

蛋白质的溶解度具有显著的特性，可以根据其溶解度的差异进行分离。其中，等电点沉淀法、盐析和盐溶、有机溶剂沉淀以及重金属盐沉淀是常用的方法。

①等电点沉淀法：蛋白质在等电点附近溶解度最小，易沉淀析出。利用不同蛋白质等电点的不同，将蛋白质从混合溶液中分开

②盐析和盐溶：

盐析：大量的中性盐溶液可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质沉淀析出的现象

盐溶：低浓度的中性盐溶液促进某些蛋白质的溶解，从而与其他组分分开

③有机溶剂沉淀：亲水性有机溶剂如乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度降低，从而沉淀析出

④重金属盐沉淀：重金属盐带正电荷，可以与蛋白质负离子结合而形成不溶性蛋白质沉淀可利用此性质以大量清蛋白抢救重金属盐中毒的人

2.根据蛋白质分子大小的不同分离

①透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开，本质是以浓度差为推动力的膜分离过程。主要应用是血液（人工肾）的解毒

②超滤：通过加压、抽滤、离心等多种方式，使水和其他小分子溶质透过超滤膜，而蛋白质截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，本质是以静压力差为推动力的膜分离过程

③密度梯度离心：蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度，将蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心，质量和密度大的蛋白质比质量和密度小的蛋白质颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各组分在离心管中被分离成各自独立的区带

④凝胶过滤层析：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入凝胶珠内部，只能随溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出体外；比凝胶珠孔径小的分子能不同程度的自由进出凝胶珠的内外。于是不同大小的分子所经的路径长短不同而得到分离，大分子先洗脱出来，小分子后洗脱出来

⑤超速离心：蛋白质溶液在强大离心场中会逐渐沉降，各种蛋白质沉降所需离心力场不同，可用超速离心法分离蛋白质并测定其分子量

3.根据电荷不同的纯化方法

①电泳：在外电场作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。利用带点颗粒净电荷的差异分离混合物

②离子交换层析：在某一特定的PH值，混合蛋白质溶液中各种蛋白质所带电荷数目及性质不同，事先在层析柱中装上离子交换剂，其所带电荷性质与蛋白质电荷性质相反，当蛋白质混合溶液流经层析柱时，即可被吸附于柱上，随后用与蛋白质带相同性质电荷的洗脱剂洗脱，蛋白质可被置换下来，由于各种蛋白质所带电荷不同，离子交换剂结合的紧密程度不同，带电量小的蛋白质先被洗脱下来，增加洗脱液离子强度，带电量多的也被洗脱下来，可将蛋白质分离

4.利用选择性吸附的纯化方法

吸附层析：利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的

5.利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法

亲和层析：把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学方法共价连接到载体分子上，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的蛋白质与配体特异性结合，而其他蛋白质则不被结合，通过洗涤除去，被特异结合的蛋白质可以用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来

6.高效液相色谱HPLC和快速蛋白质液相层析FPLC

HPLC：以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析

FPLC：是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并对相体进行改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。适用各种层析技术，专门分离和纯化各类生物分子，包括天然蛋白质，重组和融合蛋白质、肽、寡核酸、质粒、病毒、抗生素、生物碱等等，操作肽图等精确分析和小量制备应用，具有快速、高分辨率、柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。

详情可以关注义翘神州蛋白纯化技术方法：https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques