主题：【分享】北桑寄生总黄酮对硫代乙酰胺诱导斑马鱼急性肝损伤的保护作用

急性肝损伤（acute liver injury，ALI）是由无肝病或患有肝病但处于稳定状态的人员在受到长期熬夜、大量酗酒、肝脏缺血缺氧及药物中毒等因素所致^[1-2]。随着医学技术的发展，越来越多的研究者发现ALI的发生发展与炎症反应、氧化与抵御氧化系统失衡及铁死亡等密切相关^[3-5]。肝脏损伤进一步恶化，会发展为更为严重的衰竭^[6-7]，诱发机体免疫能力下降、血糖含量异常、脂质代谢紊乱等异常现象累及其他器官损伤。目前，ALI的临床防治主要采用保肝药物进行治疗，严重者会选择肝脏替代治疗^[8-10]。

现代研究发现很多中药及有效成分在防治肝病领域表现出较好的前景^[11-14]。灯盏花素可以降低丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，提高抗氧化剂超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，有效调节核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号通路，减轻酒精引起的肝损伤^[15]。秦皮甲素能够降低四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl₄）引起的小鼠肝脏中纤维沉积现象，减少AST、ALT及胆红素（total bilirubin，TBil）的含量，下调透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）、III型前胶原（procollagen type III，PCIII）和层黏连蛋白（laminin，LN）的水平，并改善肝组织炎症与脂质空泡^[16]。因此，从天然药用植物探索抗ALI活性物质仍然是目前临床防治ALI的有效途径。

北桑寄生Loranthus tanakae Franch. et Sav.是桑寄生科桑寄生属落叶灌木^[17]，寄生对象为栎属、桦属、李属等树木，在中国、日本、韩国、朝鲜等均有分布^[18]。现代研究表明北桑寄生中含有糖类、甾体皂苷类、黄酮类等次生代谢物^[19]。其中黄酮类化合物在北桑寄生药材中含量丰富（约10.58%^[20]）。目前，北桑寄生的药理活性研究较少，还尚未见北桑寄生在治疗ALI方面的研究报道。课题组前期研究显示，北桑寄生总黄酮（total flavonoids of L. tanakae，LTF）具有良好的抗氧化作用，可以促进脂多糖诱导的RAW264.7细胞中Nrf2转录活性，抑制炎症反应的发生^[21]。因此，本研究利用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）建立斑马鱼ALI模型，对北桑寄生中黄酮类化合物的保肝活性进行研究，以期为北桑寄生的药理研究提供科学依据。

1 材料1.1 动物AB野生型斑马鱼品系、CZ320肝脏荧光标记斑马鱼Tg（-1.7apoa2:GFP）和CZ59中性粒细胞荧光标记斑马鱼Tg（lyz:DsRED2）由山东第一医科大学斑马鱼中心提供。斑马鱼养殖在昼夜交替周期为14 h/10 h的循环系统中，水温控制在（28±1）℃，pH值与盐浓度分别维持在7.4、0.004%左右，每日饲喂2次丰年虾，1次普通饲料。1.2 药品与试剂LTF为本实验室自制^[22]；芦丁对照品（质量分数≥98%，批号153-18-4）购自西安瑞林生物科技有限公司；N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC，质量分数≥98%，批号616-91-1）、油红O粉末（批号1320-06-5）购自上海源叶生物有限公司；TAA（批号62-55-5）购自美国Sigma-Aldrich公司；ALT试剂盒（批号C009-2-1）、AST试剂盒（批号C010-2-1）、MDA试剂盒（批号A003-1-1）、SOD试剂盒（批号A001-3-2）、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（批号A007-2-1）购自南京建成生物工程研究所；还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）试剂盒（批号BC1175）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒（批号CA1410）购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号P0012）购自碧云天生物技术有限公司；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液套装（批号G1003）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；其他试剂均为分析级别。1.3 仪器BO-IR型组织研磨破碎仪（山东百欧医疗科技有限公司）；HC-2518R型高速冷冻离心机（中佳有限公司）；DK-98-II型电热恒温水锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SpectraMaxABS型酶标仪（CMax Plus Molecular Devices公司）；HPG-280BX型恒温培养箱（东联电子技术开发有限公司）；IX83型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；GL224I-ISCN型万分之一天平（德国Sartorius公司）；斑马鱼养殖设备（上海海圣生物实验设备有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；CRYOSTAR NX50型冰冻切片机（赛默飞世尔科技有限公司）。
2 方法2.1 LTF含量检测配制芦丁对照品溶液，绘制回归方程。称取实验室自制的LTF，配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，使用三氯化铝-醋酸钠溶液显色，利用回归方程计算LTF的含量^[22-23]。2.2 LTF耐受浓度筛选将成熟健康的6月龄斑马鱼以1∶2或2∶2的雌雄比放入产卵缸中，待自然产卵后，收集透明胚胎，用循环系统中的养鱼水清洗2次，洗去粪便与杂质，转移至干净的培养皿，添加含有少量亚甲基蓝溶液的养鱼水，放置于28 ℃恒温培养箱内孵育3 d。将受精后3 d（3 d post fertilization，3 dpf）健康AB幼鱼转移到12孔板中，每孔放入30尾幼鱼，设置对照组和LTF（25、50、100、200、400、800 μg/mL）组，各孔为4 mL体系，对照组加入含0.1%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的养鱼水，给药组加入不同质量浓度的LTF药液，记录各组幼鱼生存情况，绘制生存曲线。2.3 LTF对TAA诱导的斑马鱼肝损伤的影响2.3.1  斑马鱼荧光肝脏分析  选取具有荧光标记的3 dpf Tg（-1.7apoa2:GFP）转基因斑马鱼幼鱼于6孔板内，设置对照组、模型组、阳性药NAC（10 μmol/L）组和LTF（12.5、25.0、50.0 μg/mL）组，每孔15尾。对照组给予斑马鱼养殖水，模型组加入7 mmol/L TAA溶液，各给药组给予7 mmol/L TAA和相应药物，给药处理72 h。给药结束后，斑马鱼用三卡因麻醉，置于载玻片上，使幼鱼两眼重叠，用荧光显微镜采集同一体位图像，使用Image J软件统计幼鱼的荧光肝脏面积。2.3.2  斑马鱼体长与卵黄囊吸收延迟的面积统计  按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药结束后，使用Image J软件测量幼鱼的体长与卵黄囊吸收面积。2.3.3  HE染色  按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药结束后，将幼鱼固定后用石蜡包埋，制作切片，进行HE染色，最后用中性树胶封片。在光学显微镜下采集图像，分析各组斑马鱼幼鱼肝脏组织病理状况。2.3.4  油红O染色  按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药结束后，各组随机选取10尾幼鱼，三卡因麻醉后，用4%组织固定液于4 ℃固定12 h。用PBS洗净固定液，在摇床上分别以20%、40%、80%、100%的1,2-丙二醇梯度脱水10 min。然后，用0.5%油红O染液在水浴中避光染色1 h，再用100%、80%、40%、20%的1,2-丙二醇依次脱水15 min，最后用PBS清洗，在显微镜下采集肝脏区域图像，利用Image J软件测定肝脏处的平均光密度。2.3.5  斑马鱼匀浆蛋白浓度测定  按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药结束后，各选取45尾幼鱼，吸净水分，准确称定质量，按质量与体积1∶9的比例加入0.9% NaCl水溶液，利用冷冻匀浆机进行研磨，离心后吸取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。2.3.6  斑马鱼肝功能指标测定  按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药结束后，按“2.3.5”项下方法制备10%斑马鱼匀浆上清液，按试剂盒说明书测定AST和ALT活力。2.3.7  斑马鱼体内ROS水平检测 按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药结束后，每组收集15尾幼鱼，采用终浓度为10 μmol/L DCFH-DA荧光探针，室温避光染色20 min，在荧光显微镜下观察并进行拍照，用Image J软件统计平均荧光强度以指示ROS水平。2.3.8 斑马鱼体内氧化应激相关酶的测定  按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药结束后，按“2.3.5”项下方法制备10%斑马鱼匀浆上清液，用上清液的蛋白质浓度进行归一化处理，测定CAT、SOD、MDA、GSH的含量。2.3.9 中性粒细胞迁移数目统计  按“2.3.1”项下方法分组和给药，给药72 h后，观察斑马鱼幼鱼中性粒细胞迁移情况，统计卵黄囊附近的中性粒细胞迁移数目。2.4 数据学分析使用SPSS数据编辑器与Graphpad Prism 8.0.1软件进行数据分析及制图，多组数据之间比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA）和Duncan法，各组数据用表示。

3 结果3.1 LTF含量测定根据吸光度（A）值，计算得芦丁的回归方程为y＝10.676 x＋0.039 5，R²＝0.999 2；线性范围为0.000 8～0.056 0 mg/mL。以芦丁为对照品，测得LTF质量分数为98.06%。3.2 LTF对斑马鱼的耐受性考察将3 dpf AB斑马鱼暴露在不同质量浓度的LTF溶液中，每24小时观察记录幼鱼的存活情况。如图1所示，当LTF质量浓度为50 μg/mL及以下时，幼鱼未出现出明显的发育、形态、行为异常。随着LTF质量浓度增大至100 μg/mL，有3.3%幼鱼开始死亡。LTF质量浓度大于200 μg/mL，少量幼鱼出现脊背弯曲与游泳转圈等异常行为，死亡现象较为明显。斑马鱼给予200、400、800 μg/mL LTF处理24 h的生存率分别达到83.3%、20.0%、0。400、800 μg/mL LTF处理幼鱼48 h，幼鱼大量死亡。因此将后续实验LTF剂量控制在50 μg/mL及以下。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.3 LTF对TAA引起斑马鱼体长与卵黄囊发育的影响在评估药物对斑马鱼的肝脏毒性时，会将卵黄囊的吸收现象作为测试指标^[24]。如图2所示，TAA可引起斑马鱼幼鱼发育迟缓，鱼鳔发育肿大或缺失，体长显著减小（P＜0.01），卵黄囊吸收明显滞后（P＜0.01）。阳性药物NAC处理后，幼鱼的体长有所恢复（P＜0.01），卵黄囊吸收延迟面积逐渐减小（P＜0.05）。LTF处理后均能促进幼鱼的生长，12.5 μg/mL LTF可以增加幼鱼的体长发育（P＜0.05）；当LTF的剂量继续增大，幼鱼的体长、卵黄囊的吸收滞后现象均得到明显改善（P＜0.05、0.01）。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.4 LTF对TAA诱导的斑马鱼肝脏损伤的影响利用肝脏荧光标记斑马鱼Tg（-1.7apoa2:GFP）测定斑马鱼的荧光肝脏面积与荧光强度，考察LTF能否改善TAA诱导的斑马鱼肝损伤。如图3所示，与对照组比较，经过TAA处理的斑马鱼幼鱼，其绿色荧光肝脏面积明显减少（P＜0.01），绿色平均荧光强度下降（P＜0.01），肝脏形态发生改变。与模型组比较，NAC显著增加幼鱼的荧光肝脏面积和荧光强度（P＜0.05、0.01）；12.5～50.0 μg/mL LTF可以有效逆转TAA诱导的肝脏面积萎缩（P＜0.05、0.01），25.0 μg/mL LTF也可显著逆转肝脏荧光强度（P＜0.01）。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.5 HE染色结果如图4所示，与对照组比较，模型组斑马鱼幼鱼的肝细胞排列不紧密，胞质稀疏，某些位置出现空泡化现象。与模型组比较，25.0 μg/mL LTF干预后，斑马鱼幼鱼肝细胞排列紧凑，胞质更紧密，空泡化现象明显减少。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.6 LTF对TAA引起的斑马鱼肝功能酶的影响AST和ALT活性是反映肝脏损伤的重要因素，肝脏遭受某些刺激或损伤时，AST与ALT活性异常上调^[25]。如图5所示，将斑马鱼暴露在TAA溶液中连续处理72 h，幼鱼体内AST与ALT活性显著升高（P＜0.01），说明幼鱼肝脏出现损伤。与模型组比较，NAC组和LTF（25.0、50.0 μg/mL）组AST与ALT活力显著降低（P＜0.05、0.01）。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.7 油红O染色结果利用油红O染色检测斑马鱼肝脏区域的脂质积累程度，使用Image J软件统计幼鱼肝脏区域染色的平均光密度。如图6所示，与对照组比较，模型组斑马鱼肝脏区域的平均A值明显升高（P＜0.01），说明幼鱼肝组织中有大量脂滴的堆积。与模型组比较，NAC组和LTF（25.0、50.0 μg/mL）组幼鱼肝脏处的脂质积累程度显著降低（P＜0.05、0.01），表明LTF可以通过降低肝脏组织中的脂质堆积，进一步减轻TAA引起的肝脏损伤。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.8 LTF对TAA引起ROS积累的影响在受到外界刺激时，ROS产生过多，导致氧化程度超出氧化物质的清除，引起体内发生氧化应激^[26]。使用DCFH-DA荧光探针对ROS水平进行量化处理，如图7所示，与对照组比较，模型组幼鱼的整体绿色荧光强度明显增加，表示ROS水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，NAC组和LTF（25.0、50.0 μg/mL）组ROS水平明显降低（P＜0.05、0.01），说明LTF可以减少TAA引起幼鱼体内ROS的积累。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.9 LTF对TAA诱导斑马鱼氧化应激相关酶活力的影响如图8所示，与对照组比较，模型组斑马鱼幼鱼体内脂质过氧化产物MDA含量明显升高（P＜0.01），而抗氧化剂SOD、CAT活性及GSH含量显著降低（P＜0.01），说明斑马鱼体内的氧化与抗氧化系统之间失去平衡，抗氧化物质不能及时清除氧化产物，导致幼鱼体内发生氧化应激。与模型组比较，各给药组斑马鱼幼鱼体内SOD、CAT活性显著升高（P＜0.05、0.01），MDA含量明显降低（P＜0.01）；NAC组和LTF（25.0、50.0 μg/mL）组斑马鱼幼鱼体内GSH含量明显升高（P＜0.01）。这可能是由于NAC在体内可以转化成谷胱甘肽^[27]，增加了抗氧化物质GSH的含量，清除氧化产物的能力得到提升所致。实验结果说明LTF能够及时调控MDA、SOD、CAT与GSH水平，提高机体清除氧化产物的能力，降低氧化应激的水平，进一步缓解了肝组织损伤。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]3.10 LTF对TAA诱导中性粒细胞迁移的影响使用中性粒细胞荧光标记斑马鱼Tg（lyz:DsRED2）来检测中性粒细胞的迁移情况，指示炎症的发生^[28]，以此考察LTF能否减少TAA诱导中性粒细胞的迁移。如图9所示，与对照组比较，模型组斑马鱼幼鱼的鱼鳔和卵黄囊附近有大量的中性粒细胞聚集（P＜0.01），提示附近有局部炎症发生。与模型组比较，NAC组和LTF（25.0、50.0 μg/mL）组卵黄囊与鱼鳔附近的中性粒细胞聚集现象明显减少（P＜0.05、0.01）。表明LTF可能通过减少中性粒细胞的聚集，减轻TAA引起的局部炎症。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]

4 讨论斑马鱼是一种繁殖速率快、发育周期短、产卵量大的脊椎动物，其肝脏的发育与人体高度相似，已广泛应用于肝脏疾病的发病机制、药物筛选等领域^[29-31]。斑马鱼幼鱼在个体发育阶段呈现透明状态，无需解剖，便可以清楚直接地观察疾病的发展与药物干预的效果^[32]。TAA常被应用于肝损伤与纤维化动物模型的建立^[33-34]。Fitzhugh等^[35]用TAA处理大鼠，发现TAA能引起大鼠肝脏肿大、肝功能下降及纤维化的现象，首次证明了TAA的肝毒性作用。王洁^[36]研究发现0.06% TAA处理48 hpf斑马鱼，幼鱼出现肝脏面积变小、肝组织结构紊乱等异常现象。因此，本研究使用TAA建立斑马鱼ALI模型，结果显示，TAA可明显引起肝脏萎缩与肝功能损伤、诱发炎症以及引起氧化应激损伤等，与文献报道一致^[36-37]，可用于LTF的肝保护活性研究。LTF在斑马鱼模型上显示了肝保护作用。在本研究中，LTF可以明显逆转TAA诱导的斑马鱼生长发育迟缓、卵黄囊吸收滞后，在一定程度恢复了肝脏病理结构，增加了肝脏面积及荧光强度，改善了肝功能酶活性。LTF（25.0 μg/mL）组的效果比较明显，当剂量增加至50.0 μg/mL时，个别指标（如组织病理、肝脏荧光强度）并未显示出显著性差异，可能是由于50.0 μg/mL接近毒性剂量，引起了斑马鱼发育的异常，这也提示在后续的研究中，将深入探究LTF的量效关系以及潜在的毒性。本研究首次揭示了LTF对ALI具有明显改善作用，为后续深入研究提供了有益探索。LTF可通过减少氧化应激水平减轻肝损伤程度。TAA被肝脏吸收后，经过一系列作用，形成有毒的硫氧化物TASO₂，促进氧化应激、细胞凋亡等，影响肝功能运转^[38]，诱发机体产生肿瘤、系统性红斑狼疮、肝炎等疾病^[39-40]。氧化应激还可影响肝脏的脂质代谢，进一步引起脂质过氧化^[41-42]。庞敏等^[43]研究发现，小鼠ip TAA（100 mg/kg）后，小鼠肝组织内谷胱甘肽过氧化物酶与GSH的水平下调，脂质过氧化产物MDA增多，Nrf2表达减少，而Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）表达水平上调。本研究结果显示，TAA处理后斑马鱼体内ROS过度积累，抗氧化剂SOD、CAT与GSH含量显著下降，脂质过氧化产物MDA水平升高。25.0、50.0 μg/mL LTF干预后能够显著减少ROS和MDA水平，增加SOD、CAT与GSH的活性，提升了机体的抗氧化能力，减轻了TAA诱导的斑马鱼肝毒性。LTF通过降低中性粒细胞的迁移现象缓解肝损伤。现代研究表明TAA在诱发氧化应激反应后，进一步促进炎症介质肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等释放，激活炎症^[44-45]。在本研究中，TAA处理幼鱼后，幼鱼卵黄囊附近出现大量中性粒细胞聚集，提示局部的炎症发生。25.0、50.0 μg/mL LTF干预后，中性粒细胞迁移现象减少。研究结果进一步说明LTF可能通过减少中性粒细胞的聚集现象来改善TAA引起斑马鱼的局部炎症。综上，本研究首次发现LTF对TAA引起的肝毒性具有抑制作用，并通过维持氧化与抗氧化系统的平衡来减轻肝脏损伤，为后续深入探讨其作用机制奠定了基础。