主题：【分享】【金秋计划】病毒性肺炎中医病证结合动物模型研究进展

病毒性肺炎（viral pneumonia，VP）是由病毒入侵呼吸道上皮和肺泡上皮所致的肺间质和实质性急性炎症病变。全年都可发生，冬春季高发。易感人群多为2岁以下婴幼儿、65岁以上老人及孕产妇等。临床常见的VP病原体包括流感性病毒、冠状病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒及鼻病毒等[1-2]。腺病毒肺炎是常见的小儿VP之一[3]，主要表现为局灶或融合性肺坏死性浸润及支气管炎；呼吸道合胞病毒肺炎以肺间质及毛细支气管病变为主[4]，胸片上可见斑点状影，常伴有不同程度的肺气肿；流感病毒肺炎常可侵犯中枢神经系统或循环系统，以肺间质病变为主；甲型流感病毒肺炎较乙型流感病毒肺炎症状更严重，胸部X光片显示片状高密度影，扩散迅速，常有肺间质受累，多伴有胸腔少量积液，病灶吸收后可残留纤维灶[5]；冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力为主，可伴有消化道等症状或无症状[6]；麻疹病毒肺炎多表现为呼吸道卡他、持续发热等，并出现不同程度的疹退后脱屑、特征性皮疹、色素沉着、口腔科氏斑等临床表现[7]；鼻病毒主要感染气道上皮细胞，可引起普通感冒、肺炎、支气管炎和慢性呼吸道等多种疾病，是临床常见的呼吸道感染病原体[8]。然而，VP作为当前临床常见的一种社区获得性肺炎，在西医治疗方面一直缺乏特异性药物。相反，我国传统中医药在治疗VP过程中则拥有悠久的历史和成功经验。从中医角度看，VP属“风温”和“温病”。根据临床资料发现，清肺排毒汤、麻杏石甘汤、化湿解毒方等是临床上最常用于治疗VP的中药汤剂，且疗效显著[9]。其作用机制可能与其调控机体免疫平衡、调控体内微生态、抑制炎症反应、抑制肺纤维化、保护组织及直接抗病毒活性有关。

病证结合动物模型是一种重要的中医药疾病动物模型[10-12]，通过对证候发生发展的机制研究，可很好地展现中医“证”的不同发展阶段特征，体现疾病发展的中医病因病机，已成为中医证候研究动物模型的必然趋势，为中医基础向临床治疗的转变提供了理论依据，有利于中药筛选及方剂作用机制的深入研究，是中医药新药研发的重要途径。目前，病证结合动物模型在建模理念上已逐渐成熟，主要可划分为以下3种：（1）以中医理论为依据，中医病因病机为“证”，西医病因为“病”，构建同时具有“病”“证”2个特征的模型动物，这是一种中西医结合多因素造模理念；（2）在西医病态模式基础上观察中医病证，分别归纳疾病初期的证候发展特征及后期出现的典型中医证候，以此判断该疾病是否属于某种中医证型；（3）运用传统中医病因学方法对模式动物进行干预，通过一般状况观察、客观指标检测、常用方药反证等方法，初步建立动物证候模型，并寻找与之匹配的临床病证来进行验证，即在证候模型基础上探察西医疾病类型[13]。
目前现有的VP动物模型多为西医模型，对中医证候模型的研究还较为薄弱，不能反映中医辨证论治的特色。因此，本文对现阶段中医疾病动物模型及相关VP病证模型的建模方法、证型分类、证候研究和评价指标的研究现状进行了梳理，为建立符合中医辨证论治特点的VP动物模型提供参考。
1 VP病证结合动物模型的相关建模研究
1.1 实验动物选择
在选取实验动物时，要尽可能具有与人的相似性，并对各种治疗因子有较高的敏感性，以便能较好地模拟人类疾病症状。目前报道的VP造模动物包括Balb/c小鼠[14]、昆明小鼠[15]、美国癌症研究所ICR小鼠[16]、豚鼠[17]、叙利亚仓鼠[18]、人类血管紧张素转换酶II小鼠[19]、Wistar大鼠[20]、恒河猴[21]、雪貂[22]、树鼩[23]等。虽然部分动物如恒河猴、雪貂、树鼩的病情与人类极为类似，但造模成本高、技术难度大，尚未得到推广应用。目前临床上最常使用的中医证候造模动物仍为小鼠和大鼠，主要是由于其成本低，并且人们对其生活习性和制作方式也较熟悉。
1.2 证候的造模方法
目前公认的中医证候建模方法主要有3种，分别为西医病因病机法、中医病因病机法和病证结合法[24]。其中，病证结合法因稳定性、可操作性高、相对容易评价，且能够体现中医临床辨病与辨证相结合的特点，被认为是比较理想的造模方法[25-26]。表1归纳了3种造模方法各自的应用现状（文献研究举例）、造模依据、干预方法及优缺点。

1.3 VP中医证候学
中医大师根据中医辨证论治体系对VP的证候进行了论述，常见症状包括：发热、咳嗽、咳痰、精神乏力、鼻塞、头痛、流鼻涕、舌色红、苔黄、苔腻、脉滑、脉浮，这些是VP主要的舌象和脉象，可体现VP的中医证候特点，并且与《中医内科学》《温病学》中的相关描述基本相符。依据《中药新药临床研究指导原则（试行）》（2002年）[37]、《小儿病毒性肺炎中医诊疗指南》（2019）[38]及相关文献[39-40]，VP的中医辨证分型主要包括风寒郁肺、风热郁肺、痰热郁肺、毒热闭肺、阴虚肺热、肺脾气虚、心阳虚衰和邪陷厥阴等，对不同证型的造模方法归纳见表2。

2 VP病证结合动物模型相关评价指标的研究
病证结合动物模型研究近年来得到广泛关注和应用，针对模型建模的系统评价指标是现在研究的主要方向。目前倾向于从2个层面展开研究：（1）将宏观表象和微观指标相结合，建立人与动物四诊转换模式；（2）强调结合有效经典方药进行反证。
2.1 宏观表征评价
中医辨证以望、闻、问、切为主要手段，以患者临床症状、体征为主要依据进行综合评价，而动物模型则需在动物宏观表象上寻找可供量化、判定的依据，如以模型动物体温上升为发热表现，耸毛或蜷卧为恶寒表现[57]。在脾虚为主的湿热证动物模型研究中，周祎青等[58]发现模型组小鼠表现出精神倦怠、不思饮食、反应迟钝、毛发黯淡等脾虚为主的湿热证症状，证实造模成功。此外，在情志研究中，动物的行为变化是重要评估指标。王枭宇等[59]通过评估多种经典的模型，如旷场实验、强迫游泳实验、悬尾实验等，发现行为学指标能够反映实验动物整体变化的特征，特别是能够反映动物心理情感变化。
需要注意的是，目前对动物模型的宏观判断标准多以人的证候为依据，人与动物在某些方面存在明显差异，同时某些主观因素如动物心理和情绪等变化，都会影响宏观表征结果的可靠性。
2.2 微观指标评价
微观指标能更直观、准确地反映动物机体状态，是判断VP病证结合是否成功的重要依据。
2.2.1 一般情况观察  观察动物情绪、活动、体毛、排泄、饮食、呼吸、体质量、肛温及死亡情况等。如将大鼠置于寒冷条件下连续6 d造模，表现出恶风寒、弓背毛松、打喷嚏、流鼻涕、食欲下降、饮水增加、体温升高、体质量下降及血压升高等明显风寒感冒症状。该症状符合中医的风寒表证[41]。
2.2.2 肺脏指数的测定与肺脏损伤程度的判定 吴莎[60]提出用肺指标、肺损伤程度来评价造模疗效，结果证实病毒感染后小鼠肺部炎症反应加剧且肺指数升高。刘珊宏等[61]采用风扇吹风联合体表降温7 d的方法构建风寒犯表的太阳病小鼠动物模型，发现小鼠造模后体质量显著下降，肺指数显著升高，脾指数显著下降。同时肺部出现明显病变，表现为局部有代偿性空泡、局部出血、肺间质增生、血管壁增厚，嗜中性粒细胞浸润等。杨进等[57]给小鼠滴鼻感染仙台病毒构建风热模型，发现感染病毒8 h内小鼠肺部指标无显著变化，8 h后肺内可见轻度病灶，12 h后肺泡壁厚度显著增加，大量单核细胞和淋巴细胞浸润，说明病证已经从表到里，证实仙台病毒在小鼠滴鼻后的4～12 h可视为类表热证阶段。
2.2.3  炎症因子  近年来关于病毒诱发细胞因子释放及对病毒感染的影响研究结果表明肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是介导炎症反应的重要介质，可促进TNF-α分泌，加剧炎症发生[62-63]。王晓萍[64]采用人工气候箱、高脂饮食、甲型H1N1流感病毒滴鼻法等复制蒿芩清胆汤动物模型，发现病毒感染后TNF-α和IL-6均异常增高，同时死亡率、肺组织病理改变等结果提示模型组气道炎症反应处于持续状态，经蒿芩清胆汤治疗后小鼠肺组织中炎症因子水平显著下降，且可显著降低肺炎的发生，提示蒿芩清胆汤可能通过多靶点调控机体促炎和抑炎平衡；刘珊宏等[61]发现风寒犯表太阳病小鼠模型肺部炎性因子TNF-α、IL-6及IL-1β的表达显著增加；Wan等[65]发现寒冷造模后大鼠血清炎症因子TNF-α、L-1β、IL-6水平显著增加。
2.2.4  免疫功能  呼吸道病毒感染及其发病机制与机体的免疫状态密切相关[66]。白细胞分化抗原4阳性（cluster of differentiation 4+，CD4+）/CD8+、辅助性T细胞1（T helper cell 1，Th1）/Th2是人体内重要的免疫细胞[67]，而在动物模型中存在细胞免疫水平显著降低、免疫失衡现象。CD4+/CD8+ T细胞失衡反映了病毒感染导致的机体免疫损伤，Th1/Th2（γ干扰素/IL-4）失衡反映了内、外环境因素和病毒感染综合因素共同作用下的机体应激状态。从微观上看，CD4+/CD8+的值倒置，Th1/Th2细胞因子偏向Th1，使细胞免疫成为优势而导致肺脏损伤，加重疾病，会对证候的发展方向产生影响。通过湿热环境＋流感病毒构建流感病毒湿热证模型，采用蒿芩清胆汤能逆转湿热环境和病毒感染综合作用引起的CD4+/CD8+的值下降。蒿芩清胆汤治疗6 d后湿热证模型大鼠外周血γ干扰素/IL-4水平显著高于对照组，表明蒿芩清胆汤具有调节大鼠T淋巴细胞亚群、Th1/Th2平衡、提高抗病毒能力的作用[68]。综上，蒿芩清胆汤抗病毒免疫损伤的机制可能是通过上调细胞免疫功能，使CD4+/CD8+和Th1/Th2重新平衡从而减轻应激状态[69]。
2.2.5  水液代谢  水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一种能特异性转运水分的蛋白。是人体对水液代谢调节的关键因素[70]。迄今共发现13种AQPs蛋白，其中主要体现在肺部的以AQP1、AQP5为主。肺脏中AQP1表达下降可引起气道上皮细胞分泌增多，促进黏蛋白5ac在肺脏中的表达，从而导致气道炎症的加重，而炎性介质分泌增多，纤毛和杯状细胞比率失衡、肺部水分代谢失衡等进一步加重炎症性水肿[71]。AQP5在肺组织水代谢稳态中发挥重要作用，AQP5功能失调是导致肺损伤的重要原因[72-74]。AQP1、AQP5的表达在造模后免疫组化数值和光密度均有明显提高。如在采用环境＋膳食＋诱发因素＋生物感染因素复制湿热证病毒肺炎动物模型中，模型组大鼠AQP1、AQP5免疫组化数值较对照组显著增高，光密度增加。与模型组对比，甘露消毒丹组AQP1蛋白表达显著降低，说明甘露消毒丹治疗湿热证型病毒性肺炎的作用途径之一是通过影响炎性相关的AQP1，加快肺泡内液体的清除、减轻肺组织的水肿程度，抑制湿热证病毒性肺炎模型的炎性反应来实现的[75]。
2.2.6 血脂代谢  VP发病的内因与患者的饮食习惯密切相关，嗜食肥甘厚味，酿生痰浊从而造成了脾胃的运化功能失调，临床上血脂异常通常与其饮食密切相关，因此，湿邪与血脂异常间的关系亦受到广泛关注。有研究采用环境＋膳食（喂饲高脂肪食物）＋诱发因素＋生物感染性因素的方法建立湿热证病毒肺炎动物模型，发现模型小鼠血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇显著增高，高密度脂蛋白胆固醇显著下降，且存在脂代谢异常，证实了饮食失调是引起内湿的重要因素[69,76]。
2.2.7 Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）介导的信号通路  TLR家族在细胞表面或细胞内表达，以模式识别形式与多种病原分子结合激活固有免疫应答，是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁，在抵御病原体感染方面具有关键作用[77-82]。
潘沅[69]采用环境＋高脂膳食＋生物感染性因素的方法复制湿热证动物模型，研究发现，TLR2可以促进下游核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的过度活化，导致大量炎症因子和细胞因子的产生，造成机体自身免疫损伤。而ig蒿芩清胆汤后，小鼠腹腔巨噬细胞中的TLR2受体及其下游NF-κB分子的表达显著降低，表明蒿芩清胆汤可能通过干预TLR2/NF-κB信号转导通路调控细胞因子的产生，从而减少机体自身炎症因子造成的免疫损伤。
2.3经典方药反向验证
中药配伍要遵循“方从法出、法随证立”的原则，所选用的药和方药应与所用的证候密切相关。即在方剂学理论体系下，所选药物或方剂与其主治的证要有较强的相关性。这样可以判断证候是否复制成功。当前，VP病证结合动物模型反证方剂主要集中在中医经典名方和经验方，有麻杏石膏汤、参附龙牡救逆汤、宣白承气汤、三仁汤、蒿芩清胆汤、甘露消毒丹、茵陈蒿汤和龙胆泻肝汤等加减方剂。这些反证方剂在治疗的原则上包含了疏风解表、清热解毒、清化痰热、宣肺开闭、补气养阴、清肺扶正等配伍特点。用一些代表方剂对动物模型进行干预后，动物的临床症状和各项客观指标均得到了显著的改善。汤朝晖等[43]以清热化湿（蒿芩清胆汤）、辛凉透表（银翘散）、益气固表（玉屏风散）为代表的3个治法对风热型流感VP小鼠模型进行干预，均取得较好疗效，提示造模成功。
3 结语与展望
病证结合动物模型是联系中医基础研究与临床应用的重要纽带。中医药基础理论是中华民族几千年同疾病抗争的结晶，在防疫治疫方面积累了丰富的经验[83]，近年来，病毒性新发呼吸道传染病全球频发，而中医药在治疗VP等疫情防控中发挥了显著优势和关键作用，VP病证结合动物模型也开始受到越来越多的研究和探索，近年来发展较快。但另一方面，尽管VP动物模型研究在证候模型建模方法等方面已有很多创新，但仍然存在一些难点问题需要和重点关注。
首先，目前VP证候模型的造模方法还很不完善。如风寒郁肺[41]、肺脾气虚模型[52-53]中常使用病因建模，但却在造模时未与病毒相结合，如何使用病毒来复制风寒郁肺、肺脾气虚模型可能是未来的研究方向；目前诸如痰热郁肺模型在细菌性肺炎中有较成熟的造模方法，心阳虚衰模型则多用于冠心病[55]、心衰[84]等，而尚未有关于痰热郁肺模型[45]、毒热闭肺模型、心阳虚模型、邪陷厥阴模型在VP中的造模方法和应用报道，如何借鉴其他病证构建VP病证结合模型也是后续需要重点关注的难题；VP阴虚肺热模型[39]目前还常用单因素造模方式，而单因素的改变难以复制理想的病证结合模型，存在齐同性差的弊端；在西医造模基础上施加中医证候干预因素的造模方法，亦无法很好地反映病证间的因果关系，无法准确识别疾病主证类型，未来基于证候建模的疾病诱发因子的引入有望成为解决这一难题的重要思路。
其次，实验动物的选择和模型评估技术也是目前制约VP病证结合模型研究的主要难点。目前常用的大鼠、小鼠在某些结构、功能、代谢和疾病表征方面尚不能很好地模拟人类病证特点，同时模型评估指标尚无统一规范，且因动物和人类疾病的差异性，很多动物模型无法直接应用于人类证候表征，而微观指标由于存在“一证多方”及多个证候叠加等现象，均给评估带来了巨大困难。
中医证候研究是一个复杂的过程，建立病证结合动物模型要以中医药理论为指导，与现代医学的理论方法相结合，融合多学科知识，从基因组、蛋白质组学、代谢组学、生物信息学等多层次进行深入研究[85-86]。虽然VP病证结合动物模型尚处于不断探索阶段，但随着新知识、新技术的不断融入和创新，相信不久的将来能够得到迅速发展和完善，更好地反映中医“证”的本质，为推动中医药现代化与国际化做出重要贡献。