主题:【分享】白头翁皂苷B4衍生物靶向丙酮酸羧化酶改善结肠炎

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白头翁皂苷B4(Anemoside B4,AB4)是一种来自白头翁 ( Pulsatilla chinensis)的三萜皂苷,具有显著的抗炎活性,可用于治疗炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)。然而,由于其高分子量和明显的水溶性,其应用受到限制。通过合成AB4衍生物发现治疗IBD的新的有效药物是一种可行的策略。




1、AB4 C-3 连接的寡糖是其抗炎活性的重要基团


在合成两种AB4衍生分子探针的过程中,作者发现AB4-生物素(AB4-Biotin)和AB4-香豆素(AB4-coumarin)与AB4相似,具有抗炎活性。白头翁苷D(pulsatilloside D)没有抗炎作用,白头翁苷D的结构与AB4极其相似,仅与苷元C-3连接的糖链略有不同,这表明糖链可能在其抗炎活性中发挥着至关重要的作用。与AB4相比,两种分子探针仅在苷元的C-28处具有不同的取代基,表明这些基团可以被替换以制备更多的AB4衍生物。然后,通过活性筛选,有可能获得抗炎活性更强、理化性质更好的化合物。


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图1 化学结构(A)AB4,(B)Pulsatilloside D,(C)AB4-Biotin,(D)AB4-coumarin


2、AA3对DSS诱导的结肠炎小鼠没有治疗作用


在作者之前的研究中,使用NaOH去除C-28连接的寡糖,得到白头翁苷A3(AA3),从理化性能来看,AA3较AB4有显著的改进。之前研究发现,AA3可通过抑制PGE2-EP4的激活和Th17细胞分化来减轻EAE小鼠的炎症损伤,同时,AA3还抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路,诱导M1巨噬细胞极化,因此作者评估了AA3对IBD的潜在治疗作用。不幸的是,通过疾病活动指数评分、体重和结肠长度等指标的评估发现AA3对DSS诱导的小鼠结肠炎没有治疗作用。作者在本研究中以AA3为起始原料,设计并合成了一系列AB4衍生物。


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图2 AA3对DSS诱导的结肠炎小鼠没有治疗作用


3、AB4 衍生物的体外抗炎作用


作者首先合成了28种AB4衍生物,其中化合物A3?4、A3?19、A3?27和A3?29表现出较强的细胞毒性,而其余化合物对THP-1细胞的活力影响不大。前期作者发现丙酮酸羧化酶(PC)是AB4治疗IBD的分子靶点,作者本研究发现A3-6、A3-7、A3-10、A3-16、A3-24、A3-26和A3-28抑制PC酶活性与AB4相当。为了探索上述7种AB4衍生物的抗炎活性,作者研究了这七种化合物对NF-κB信号通路激活的影响,因为它已被证明是炎症性疾病的关键信号通路。Western blotting分析结果显示,A3?6和A3?24比AB4更能有效抑制p-IκBα蛋白水平(NF-κB 激活由IκBα的磷酸化介导),并表现出更好的抗炎活性。


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图3 蛋白质印迹检测IκBα


作者进一步证实 A3?6 的抗炎活性,发现A3?6能够以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的p-p65和p-IκBα增加,激活的NF-κB通路促进多种促炎基因的表达,且与AB4 相比表现出优异的抗炎活性。此外,A3?6而不是AB4能够更显著抑制NLRP3炎症小体的激活来减轻炎症反应。


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图4 A3?6通过抑制NF-κB和NLRP3炎症小体途径发挥抗炎作用


4、A3?6 改善DSS诱发的结肠炎


为了评估A3?6对溃疡性结肠炎小鼠的治疗效果,作者使用DSS诱导的实验性结肠炎模型来评估A3?6的体内抗炎作用,发现A3?6减少了DSS引起的结肠炎小鼠体重减轻,降低疾病活动指数,改善结肠缩短。此外,治疗后体重和器官指数没有明显变化,表明 A3?6 对小鼠的毒性较低。这些结果表明A3?6改善了DSS诱导的实验性结肠炎,且不会对小鼠产生毒性。


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图5 A3?6 改善DSS诱发的结肠炎


5、A3?6 与丙酮酸羧化酶(PC)结合


作者之前的研究通过蛋白质组学发现AB4显著改变了TNBS诱导的大鼠中的丙酮酸代谢和三羧酸(TCA)循环中的蛋白。PC是TCA的关键酶,有报道其参与影响炎症反应,且作者最近的研究表明AB4作为一种新型PC抑制剂,可以与PC结合,抑制 LPS 驱动的炎症和氧化应激。基于以上发现,作者推测PC可能是AB4衍生物A3?6的直接目标。于是通过分子对接预测了两者的结合及结合位点,通过SPR、CETSA、DARTS证实了A3?6 与PC直接结合。免疫荧光分析显示A3?6的类似物A3?10(AB4-香豆素)可以进入THP-1细胞并与线粒体中的PC共定位,进一步证实了A3?6直接与PC结合。


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图6 A3?6 与丙酮酸羧化酶(PC)结合


6、A3?6的体外抗炎作用依赖于PC


A3?6可以特异性结合PC,但尚不清楚A3?6如何调节PC。作者用蛋白质印迹发现A3?6不影响PC 的蛋白质水平,进而酶活检测发现A3?6显著降低 LPS 诱导的 PC 活性。进一步研究发现A3?6 的抗炎作用与PC活性相关。这些结果表明PC在A3?6的抗炎作用中发挥着至关重要的作用。


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图7 A3?6的体外抗炎作用依赖于PC


7、PC 在体内介导A3?6的抗结肠炎作用


为了研究A3?6对DSS诱导的结肠炎的治疗效果是否依赖于体内PC,作者研究了DADA(一种PC激动剂,用于提高PC活性)对A3?6治疗小鼠的作用。发现A3?6 有效缓解了DAI评分的增加和结肠长度的缩短,然而,DADA的存在逆转了A3?6对结肠炎的作用。更重要的是,最低剂量的A3?6的治疗效果并不弱于AB4。


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图8体内评估A3?6的抗结肠炎作用


接着作者检测了促炎细胞因子IL-6水平,发现A3?6 对 IL-6 的释放表现出浓度依赖性抑制作用,DADA 显著逆转了A3?6 治疗小鼠的结肠促炎细胞因子 IL-6 水平,PC催化丙酮酸羧化为草酰乙酸,草酰乙酸是TCA循环中不可或缺的代谢物。作者发现A3?6也能影响体内 PC 活性和丙酮酸代谢,此外,A3?6抑制小鼠结肠组织中DSS诱导的IκBα降解和P65磷酸化,并且DADA有效逆转了A3?6的作用,这些结果进一步证实A3?6通过抑制PC/PA/NF-κB通路发挥抗炎作用。


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图9 PC在体内介导A3?6的抗结肠炎作用


总结


该研究通过结构修饰制备衍生物来增强AB4的抗炎活性和口服适用性,通过去除某些糖单元,所得AB4衍生物表现出降低的分子量和改善的水溶性。这种修饰有助于更容易地渗透细胞膜和线粒体内膜,增强其与位于线粒体基质中的PC(靶蛋白)的结合。此外,AB4衍生物的理化性质得到改善,可实现更好的吸收和更长的消除半衰期,可能导致治疗IBD所需的口服剂量减少。在这些衍生物中,A3?6被发现具有最高的抗炎功效。此外,在体外和体内研究了A3?6的抗炎机制和下调信号通路,发现A3?6是一种新型PC抑制剂,特异性地与PC结合,抑制PC活性,从而通过PC/NF-κB/NLRP3炎症小体轴减轻结肠炎。这些结果表明A3?6 是一种有前途的抗炎剂,能够通过靶向PC来减轻DSS诱导的结肠炎症。同时,PC已被确定为直接抗炎靶点,并可能作为治疗结肠炎的理想靶点。
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