一個分析方法要選擇使用內標或外標法來定量,並沒有一定的規定,所以這裡就嘗試來分析一下, 如何找到一個合適的定量方式, 怎麼去選擇一個內標準品 .........
內標準品的選擇
傳統上在教科書中都會很模糊的告訴學生內標準的選擇方式,例如說要選安定性好;與分析物性質要相近;在分析的基質中不能出現等,現在我對這些個" 選擇方式"沒有太大的興趣,因為這個大家都知道,那現在就從另一個角度的來看看內標準品的選擇還有哪些需要注意的.
1. 只選一個內標準品?
當然, 如果你的分析目標物就只有一個, 在正常的狀況下,內標準"應該"也只會有一個才對! 但是如果你的分析是多成份的,那就必須十分小心地看待在一個分析方法內標準品的選擇, 如果分析物的在層析圖中是平均分布在各處, 那你就必須看看你的檢測方法中是否有規定內標物與分析物之間的滯留時間差範圍是多少,依此規定來選擇內標,但是如果並沒有規定,最好也是選擇一個以上的內標來使用,因為即使化學性質不會差太多,但在沸點方面卻會有滿大的差異, 內標與分析物的沸點差異過大,在GC的注射口中就無法把因為discrimibation所造成的誤差校正回來.
如果你的分析物是性質相差頗大的 (例如說同時含有醇,酸...),那別懷疑一定是要使用一個以上的內標準品,如果多個物種再加上多成份,那就很複雜了. 最低的限度也要依照分析物的沸點高低來使用多個不同的內標準品. 在美國環保署的檢驗方法USEPA 8270C,是一個檢測半揮發性的污染物的規範,前後列了不下一百種的分析物,就使用了六個不同的內標準品作為校正的依據,來照顧到各個不同沸點的分析物!!
濫用藥物分析大概是最嚴謹的了,即使是結構性質極相近的分析物,例如morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析時為求準確,都是以各自的D同位素取代的標準品作為內標.
2.基質中一定不能存在?
這個問題當然是肯定的, 不然定量結果會很不穩定或者是很淒慘. 但是有些時候你根本不知道哪些東西在分析樣品的基質中不會存在! 這時候怎麼辦? 找以往的文獻看看別人是用甚麼,這是一個方法, 但要注意的是文獻不一定就是對的! 使用分析物的氫同位素(D)取代物,是最妥當的,但問題是價格昂貴,而且不是每一種分析物的氫同位素(D)取代物都有販售,當然,如果本錢夠,你可以去訂購專門替你合成氫同位素(D)取代物. 如果要自己選, 那就必須了解一下分析物的成分了.
以前曾經替人定性和定量過一陣子海水魚中所含不飽和脂肪酸,這魚中不飽和脂肪酸的碳數都是奇數(或是偶數, 我已經忘了), 所以內標就使用了幾個偶數(或奇數)的不飽和脂肪酸, 像這種內標物絕不可能出現在分析物中,且性質十分相近,所以定量的結果一般誤差都不會太大! 如果完全無法確定怎辦? 有時候就是賭一賭囉.........舉例來說:如果你的分析物結構中含有氯的話,就可以尋找一個化合物,而這個化合物是把其中的氯換成氟或溴,例如你可以使用2-氟聯苯或2-溴聯苯來當作分析2-氯聯苯的內標準品. 以環境分析為例,通常在自然界中的氟及溴化物並不多, 在EPA的方法中,就經常把結構相似的氟及溴化物添加入樣品中,來做為分析含氯化合物的QC樣品.所以找氟及溴來取代氯原子的化合物來作為內標,基本上還算是很安全的.
如果實在連上述轉換一個基團的內標都找不到,那至少在選擇時一定要找同一類的,分析酸就找酸當內標,分析醇就找醇當內標,直鏈結構分析物就不要找一個環狀的化合物來當內標,分子量不要相差太大,這算是最基本的要求!!
3.內標和分析物的滯留時間必須接近?
這個說法原則上沒錯,因為如果滯留時間接近,它們的物理或者是化學的性質在某種程度上是接近的,所以有些分析方法會有這樣的規定. 但在某些特殊的狀況下卻出了問題, 事實上還真的碰過, 結果在更換到第三個內標準品後, 它的RT遠離分析物, 反而解決了定量誤差的問題!! 這個案例以後有空在來聊聊.
4.內標的濃度應該是多少?
除了某些分析方法會規定必須加入多少濃度的內標外,其他的就只能靠分析員自己來決定了. 以我為例, 通常會先決定一個分析方法的檢量線範圍,然後開始配製不同濃度的內標準品來注射入儀器中,分析完後選出一個大概是檢量線最高濃度的波峰高度三分之二左右的濃度,作為該項分析的內標濃度. 這樣的選擇方式,可以兼顧到高低濃度的需要,一般來說,內標濃度過高除了會增加成本之外,對於低濃度的校正是會產某些程度的誤差.
在某些分析方法中會強制妳使用內標法而不是外標法或線性迴歸的方式來定量,但是如果你的基質很複雜,一針打進儀器中,結果大大小小的出來一堆波峰, 這個時候如果你又不是使用質譜作為偵測器的話,就必須考慮加大內標準品的使用濃度, 來降低內標準品的可能發生的積分誤差!!
5.內標準怎麼配製?
一但決定了添加內標準品的濃度,就可以開始配製分析時所用的內標準品標準溶液,相對於測試時的小量, 分析員必須先估計妳在這一批的分析樣品有多少, 然後計算整個分析需要添加入多少的量,例如說妳需要大概100mL的內標準品標準溶液,這時就必須再加多30%以上,一次就配好整個分析要用的量! 分裝或者是整瓶放到-20度的冰箱中存放,免得做到一半發覺內標準品標準溶液用完了,再重新配製一次,如果你是分析的新手, 搞不好前後兩次配得不一樣濃度,那就會很悽慘了…..有些領域的分析,很重視這種內標波峰的積分值是否是有一定的再現性!!
講完了內標準品, 下次就可以來看看內標法和外標法了………..