主题：[推荐]：薄层鉴别的操作规程zt

4.3展开室状况
溶剂的蒸气相在展开箱中也参与色谱展开而形成三维的层析过程，展开箱的气体空间在层析过程中起着重要的作用。以下有四种常见的情况（A、B、C、和D）。

4.3.1方法A（展开室不饱和）

方法A的特点：
l    不呈饱和状态
l    无滤纸
l    只有一个槽内有溶剂                 
l    每个展开室只有一块TLC/HPTLC板
l    薄层向里（如图4）

图4：有溶剂和TLC/HPTLC板的双槽展开室
方法A的操作程序：
TLC/HPTLC板在倒入相应量的展开剂后立即放至展开室中，薄导层板应垂直地竖放在溶剂中，薄层向里，展开室盖上后层析立即展开。
对某些分离过程，在产品专用方法中有明确的说明时，另一槽可盛放一些调节液体（乙酸，浓氨水等）。

4.3.2方法B（部分饱和，无滤纸）

方法B的特点：
l    不完全饱和
l    无滤纸
l    在两个槽内盛放溶剂                       
l    每个展开室只有一块TLC/HPTLC板
l    薄层向里（如图5）



图5： 有溶剂和TLC/HPTLC板的双槽展开室
方法B的操作程序：
将展开剂倒入至两个槽内，盖上盖子，置放15分钟后，将盖子移向一边，TLC/HPTLC板涂层向时地竖放入溶剂中，盖上展开室，让TLC/HPTLC板开始展开。
对某些分离过程，在产品专门方法中有明确的说明时，另一槽可放置调节液体（乙酸，浓氨水等）。

4.3.3方法C（展开室饱和，有滤纸）

方法C的特点：
l    用放入滤纸使饱和（至少30分钟）
l    在两个槽内盛放溶剂                       
l    每个展开室只有一块TLC/HPTLC板
l    薄层面向滤纸（如图6）
l   
图6： 有溶剂、滤纸和TLC/HPTLC板的双槽展开室
方法C的程序：
将展开剂倒入至两个槽内，将与展开室相同型号的滤纸（如CAMAG序号022.5243）用规定量的溶剂湿润后贴在玻璃展开室正面，盖上盖子，放置30分钟（标准时间），然后将盖子移向一边, TLC/HPTLC板薄层面向着滤纸竖放入溶剂中，盖好展开室让板进行层析。
对某些分离过程，在产品专用方法中有明确说明时，另一槽可置放调节液体（乙酸，浓氨水等）。



4.3.4方法D（展开室饱和，薄层预稳定）

方法D的特点：
l    薄层预稳定，放置滤纸使展开室饱和
l    溶剂量增加一倍
l    每个展开室只有一块TLC/HPTLC板
l    薄层面向滤纸(如图7)

图7：有溶剂， 滤纸和TLC/HPTLC板的双槽展开室
方法D的程序：
将展开剂倒入至一个槽内，将与展开室相同型号的滤纸（如CAMAG序号022.5243）用规定量的溶剂湿润后贴在玻璃展开室正面，另一槽空着,TLC/HPTLC板薄层面向滤纸地置放在空槽中，除非产品专用方法另有规定，15分钟（标准时间）后，稳稳地倾斜使足够量的溶剂移至有TLC/HPTLC板的槽中（图8，只有用20x20和20x10cm的展开室才能这样做；若为10x10cm的展开室，溶剂需从外部用移液管或类似器材实现转移）。

图8： 倾斜的双槽展开室
图9：有溶剂，滤纸和经预稳定TLC/HPTLC板的双槽展开室，层析开始

4.4参数

4.4.1温度
  薄层色谱分析一般在室温中进行。对这过程，温度在20 - 25ºC算不上是临界值。 在这过程，中无短期的温度波动才是更为重要（避免抽风）。展开室应放置在无直射阳光和不通风处。温度波动对层析结果不利，故将展开室放在靠近窗口或热源处是欠妥的。

4.4.2空气湿度
空气湿度极高或极低主要影响有非极性溶剂 体系的无机涂层。相对空气湿度高于70-80%会影响薄层钝化，使Rf值增加。样品点样后，TLC薄层可置放在适当的硫酸和水的混合物的上面不少于30分钟，调整至指定的相对湿度。有关这方面的更多资料可从HPTLC Vario系统的操作手册中获得。
另一方面，在样品点样前，TLC/HPTLC板可在105ºC再活化30分钟进行干燥。然后薄层必须用一块玻璃板保护起来，只有起点区露出以便于样品点样。
若空气太干燥，可在干燥器中将TLC/HPTLC薄层置于水的上方以达到所要求的状况。
确定合适的层析条件的有效方法（用规定的湿度，溶剂蒸汽或溶剂调整使薄层达到要求的状况）是使用HPTLC Vario体系。
控制相对湿度用的硫酸溶液下表：
相对湿度    所需硫酸浓度（V/V）
    硫酸（ml）  +    水（ml）
32%47%42%58%65%72%88%    68.0          10050.0            10057.0          10039.5          10034.0          10027.5          10010.8          100

5． 层析后衍生作用
若层析板分离的物质肉眼看不见又不能被紫外光活化，需加试剂 方能显色或发射荧光者，则需使用适当的试剂浸渍或均匀喷洒于薄层板面上，直接观察或加热显色后观察。加热显色者须注意加热时间和温度，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板，加热温度过高或时间过长，容易引起板面的焦化，如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果。有的成分加试剂后，如挥发油成分经香草醛硫酸显色，加热温度和时间长短不同或放置时间不同均可能使斑点的显色有所改变。
有的品种可熏以试剂或试液的蒸气（如碘蒸气、氨蒸气）显色。

5.1 喷雾

试剂溶液以气溶胶的形式均匀地喷洒在薄层上。电动的TLC喷雾器用最少的试剂溶液产生几近理想的气溶胶。
5.2 浸渍

使用适当的设备如色谱浸渍设备III（Chromotogram Immersion Device III）,TLC/HPTLC板浸渍具有重现的结果。通过设定垂直方向速度（进入，抽出）和规定停留时间，浸渍条件可被精确地标准化。

6．检测

6.1 定性分析（同一性试验）

在相同的状态下（相同类型的TLC/HPTLC板、相同的溶剂体系组成、相同的组份点样体积和其它TLC设备系统），样品成份的Rf值、颜色、与专用的或特殊基因衍生化试剂的反应和参考物或标准物在同一TLC/HPTLC板同时层析所得的结果相符时，未知物就可认为是存在而被鉴别出来。分析的结果可以采用照片，照片复制品，影像记录（如：CAMAG 薄层色谱数码成像系统）或TLC扫描仪方法记录下来。
当混合物物质被测试时，参考标准物中单个馏份的Rf值可能会与纯物质的Rf有所不同，但测试物理学馏份和标准化馏份的hRf值必须相符，其DhRf在 ± 3之内。
为增加测试物与参照物同一性的可信度，采用TLC扫描仪实时记录其紫外光和可见光图谱并进行比较。多波长测定将测试物和参照物的图谱情况和hRf值相关联供进一步鉴别。

6.2 定量分析
（仪器：CAMAG scanner-3；具体操作请参考操作手册或教学软件）

定量分析采用光密度扫描法来评价。用winCATS 软件控制薄层色谱扫描仪以及进行扫描结果的数据处理，计算出各成分的峰高和峰面积及其平均值和离散系数（CV）或置信窨（CI）。通过单水平或多水平校准计算出结果。最后以报告形式将所有扫描参数、原始资料及图像结果保存及打印。
扫描狭缝宽度根据被测成份斑点的大小来调整（1）点状点样得到TLC中各成份，扫描其全宽度；（2）条带状点样，通常可以扫描其色谱带同心部份的50 - 70%。
物质的扫描波长可以通过光谱扫描来决定。
TLC/HPTLC板空白部位的漫射反射光用光电倍增器（PM）来收集并定其值为10% （=0% 吸收）。扫描吸光物质时，其吸收随着物质的量而增加。
对于具有荧光或可转变成具荧旋光性衍生物的物质的测定。光源一般使用发射光谱在254 - 578 nm之间的高压汞蒸汽灯，在254，302，313，366，405，436，546和578nm处有特别高强度的谱线。吸收了选择性激发波长后TLC中各成份发射出的较长波长荧光由光倍增器记录下来，使用锐截止滤波器或窄带滤波器将会阻止TLC/HPTLC板反射的激发波长光到达光电倍增器。和吸附测定一样，荧光强度作为板上定位的函数作图得模拟曲线（荧光定位曲线）（图10）。TLC扫描仪的测定原理在有关的设备文献中有报导。
荧光测定比吸收测定优越在于如下几点：（1）检出极限低1 - 3个数量级；（2）在较宽的浓度范围内校准曲线呈线性；（3）选择性较高。

图10： a) 有好几个成份的TLC/HPTLC板
b)    TLC/HPTLC板的模拟曲线
在测定极限以上所有的检测成份可被量化。在检出极限以上而在测定极限以下的检测成份会给出检出和测定极限的平均值（作为结果）。
7． 标准条件

下述的两个标准条件对不同的板规格适用。在产品专用试验方法中，应参考这一普通的分析方法。标准条件或对标准条件的偏差必须限定。

7．1 HPTLC板

10 x 10和20 x 10 cm HPTLC预涂板的标准条件总结如下以便于参考。

薄层    商品化生产的HPTLC板
规格    10 x 10和20 x 10 cm板；由样品数目决定
点样    用毛细管移液管或Nanomat进行斑状点样或用自动点样器作条状点样
数量    一般，斑状点样用20 nl - 1 ml, 窄条点样用2 - 20ml
定位    起点在距板下缘10 mm处
溶剂    数量限定采用体积量或绝对量。一般，对10 x 10 cm双槽展开室的一个槽加5ml,对20 x 10 cm双槽展开室的一个槽加10ml
分离距离    5 cm
展开室    对10 x 10或20 x 10 cm板用双槽展开室
分离模式    线性（上行式或水平的）
饱和    （A）    无滤纸放入；溶剂和TLC/HPTLC板同时加入到展开室中。
    （B）    无滤纸放入；至少在层析展开开始前10分钟将溶剂倒入至展开室中。
    （C）    放入滤纸；至少在层析展开开始前30分钟将溶剂倒入至展开室中。
    （D）    放入滤纸；用溶剂蒸汽将在无溶剂的空槽中的TLC/HPTLC板调整其状况不少于10分钟。将展开室倾侧使层析展开开始。这方法只在用20 x 10 cm板的双槽展开室适用。用10 x 10 cm板的双槽展开室，溶剂需从外面用移液管或类似方法注入。
温度    室温，通常为20 - 25ºC
空气湿度    无机薄层必须在室温，相对湿度50 - 60%下达到平衡
检测    如各相应的方法所规定
7．2 TLC板

20 x 20和10 x 20 cm TLC预涂板的标准条件总结如下以便于参考。

薄层    商品化生产的TLC板
规格    20 x 20cm， 20 x 10cm或10 x 20 cm（标准的）板；由点样样品数目决定
点样    斑状点样用标准的用后即弃的毛细管移液管，条状点样用自动点样器
数量    一般，斑状点样用1 ml - 5 ml, 条状点样用2 - 20ml
定位    起点在距板下缘15 mm处
溶剂    数量限定采用体积量或绝对量。一般，对20 x 10 cm双槽展开室的一个槽加15ml,对20 x 20 cm双槽展开室的一个槽加25ml
分离距离    对20 x 20 cm展开室为12 cm，对20 x 10 cm展开室为7 cm
展开室    对20 x 20或20 x 10 cm板用双槽玻璃展开室
分离模式    线性（上行式或水平的）
饱和    （A）    无滤纸放入；溶剂和TLC/HPTLC板同时加入到展开室中。
    （B）    无滤纸放入；至少在色谱展开开始前10分钟将溶剂倒入至展开室中。
    （C）    放入滤纸；至少在色谱展开开始前30分钟将溶剂倒入至展开室中。
    （D）    放入滤纸；用溶剂蒸汽将在无溶剂的空槽中的TLC/HPTLC板调整其状况不少于10分钟。将展开室倾侧使色谱展开开始。这方法只在用20 x 10 cm板的双槽展开室适用。用10 x 10 cm板的双槽展开室，溶剂需从外面用移液管或类似方法注入。
温度    室温，通常为20 - 25ºC
空气湿度    无机薄层必须在室温，相对湿度50 - 60%下达到平衡
检测    如各相应的方法所规定
铺板
铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。

点样
尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。

展开剂配制
选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。

展开系统的饱和
一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。

温湿度的控制
温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。

显色
喷显色剂显色最重要是有好的雾化器

薄层色谱法的相关知识简介

作者：佚名  资料来源：色谱网  点击数：  更新时间：2005-4-21


薄层色谱法，系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。1.仪器与材料(1) 玻板 除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格,要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。 (2) 固定相或载体 最常用的有硅胶G、硅胶GF<[254]> 、硅胶H、 硅胶HF<[254]>,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、 微晶纤维素F<[254]>等。 其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上, 后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5～0.7％)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓冲液的薄层。 (3) 涂布器 应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。 (4) 点样器 同纸色谱法项下。 (5) 展开室 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。 2.操作方法 (1) 薄层板制备 除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后，倒入涂布器中,在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。 (2) 点样 除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径及点间距离同纸色谱法,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。 (3) 展开 展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。 将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中）,密封室盖,待展开至规定距离(一般为10～15cm),取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。 (4) 如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。 薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。

资料很丰富。尽管天天用薄板，但还不知道有这么多讲究。

写得很详细具体，收下了！

资料很丰富 ,谢谢楼主

这个条件：
温度 室温，通常为20 - 25ºC
空气湿度 无机薄层必须在室温，相对湿度50 - 60%下达到平衡
变成下面的条件应该也可以：
温度 室温，通常为18 - 26ºC
空气湿度 无机薄层在室温，相对湿度45 - 65%下达到平衡

资料很多，坦白地说，我没细看~
不过谢谢分享~