BL/CL 生物传感器
BL/CL被作为一个检测系统在生物传感器中使用,严格意义上是指作为生物识别系统中的分析装置并与传导装置接触,相关的酶被固定在各种不同形式的装置上。这些系统主要是基于耦连的酶促反应并引发光子的发射。[45,46]
BL/CL 重组全细胞生物传感器
近来,BL生物传感器的研究急速的发展,主要是应用在遗传工程细胞(细菌,酵母或哺乳动物细胞)中,会针对被分析物质反应产生BL信号。在细胞中引入报告基因融合到一个调控DNA序列后,并在被分析物存在的情况下被激活及紧密调控,如图Figure 1a所示。基于细胞的检测方法的一个重要特性是其可以经得起自动化高通量筛选的检验。
目前已有多种BL全细胞生物传感器用来进行环境监测(如表2)。它们可以检测多种普通的胁迫条件,有毒物质,氧化剂,金属和组织寄生物[47],和一些可以激活报告基因的分子(例如,内分泌活性物质或者多卤化芳香碳氢化合物)[48] 或其他细胞物质(例如,海藻生体毒素)[48]。全细胞生物传感器可以检测污染物中生物片段(例如,片段可以进入活体细胞并激活特定的反应途径),可以获得以其它分析技术很难获得的环境和毒物学的相关信息。基于BL重组全细胞的检测方法同样可以应用到药物筛选中,可以检测待筛选药物与药物靶点的特异性结合。例如,通过监测报告基因的激活状态可以评估激动剂和对抗剂。这些检测方法为功能性检测,可以在一定的生物学背景中测量待筛选药物在特定胞内途径中的作用,而不是获得简单的结合证据。
同一细胞内可以使用两个报告基因可以单独表达并单独检测。例如,一个生物传感器可以同时检测氧化和基因毒性的损害[49]。我们还研究出一个带有内部反应校正系统的荧光双报告基因生物传感器[50]。两个荧光报告蛋白使用不同的发射光谱。一个报告基因提供了分析信号,而第二个则被用做内参照物。任何以后表达水平的修饰都可以检测生物传感器反应和分析信号校正的非特异性变化。这与环境样品分析显著相关,而环境样品分析正以其影响细胞活性的复杂和多变的基质组成而著称。虽然可以设想其应用前景,但在同一细胞使用两个报告基因的研究目前还很少被报道。
免疫检测
BL/CL已经广泛的应用到免疫检测中进行标记物的超灵敏检测。CL免疫检测不但可以通过以CL分子直接标记抗原或抗体,也可以以CL底物标记可被检测的酶。现在,80%的常规临床分析的免疫检测都是使用酶标记。相比同位素检测,CL检测以其更加灵敏和可检测性获得越来越多的应用。依赖于碱性磷酸酯酶(AP)的CL检测和依赖于辣根过氧化物酶的增强性CL检测是最常用的形式。BL反应也已经被证明是检测酶标记的极为灵敏的方法,依赖于萤火虫荧光素酶热稳定突变体标记的醋酸激酶BL检测可以得到极低的检测极限(8.5x10-23 mol)
作为一种新的生物技术工具,BL/CL免疫检测具有一个光明的前景。BL免疫检测中利用发光蛋白(例如,重组水母蛋白)[52]或者一个编码萤火虫荧光素酶基因片段作为标记[53]。多种双功能生物发光分子已经被准备应用到免疫检测中。例如:通过BL蛋白与生物素蛋白受体多肽融合获得的热稳定萤火虫荧光素酶-生物素复合体[11];化学抗体与一个特异性抗体和BL标记[12];通过一个BL蛋白或者一个合适进行CL检测的酶与被检测蛋白或多肽的融合,从而获得BL/CL tracer进行竞争性免疫检测[54,55]。随后的方法将比传统的化学结合的方法更为方便。
这些方法中分析物:标记物恒定1:1的摩尔比非常适合与研发超灵敏的检测方法。融合蛋白已经被用于基于BRET的开放式三明治式BL免疫检测(OS-BLIA),此方法以被证明比基于FRET的检测方法更为灵敏[56]。这种方法是依赖于抗原的抗体重链和轻链的重聚,其分别与Rluc或EYFP融合。
CL 和 BL现在已经越来越多的在蛋白分析的western杂交中使用。例如球蛋白(显性)印迹检测[57]和利用免疫印迹检测牙龈缝流体中伴放线放线杆菌的IgG抗体亚型[58]。
其他各种“闪亮”的生物技术应用
生物处理
可以使用BL作为一个内部参照进行在线持续监测发酵过程。先将BL报告基因引入包含有发酵产物基因的质粒中,再将在线发光检测装置整合到自动发酵系统中,从而可以精确的追踪发酵产物的形成过程[59]。而且,通过引入发光报告基因,可以在工业处理中评估细菌的状态,例如在化学制品批量生产和地下水污染退化(生物治疗)应用中。
酶抑制剂筛选
一种BL检测方法可以用来检测蛋白酶活性。水母融合蛋白(配合一个最优的自然蛋白酶酶切位点)被固化在微孔板空内,作为HIV-1蛋白酶的底物。蛋白酶水解键后从固态上释放出水母蛋白,从而增加了BL信号[61]。这个系统可以通过在BL融合蛋白中引入特定的酶切位点而针对不同蛋白酶进行抑制剂筛选。
核酸检测
基于CL的检测(例如,AP发光底物1,2-二恶二酮和HRP发光增强性CL底物)仍然对各种DNA诊断技术产生重要的影响。通过与地高辛-地高辛抗体或生物素-链酶素标记结合的基因探针杂交检测越来越多的应用到病毒DNA检测中。多重PCR扩增技术已经用来检测沙眼衣原体、Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasmaurealyticumand Mycoplasma genitalium in urine specimens,其检测限度达到1-10 x 10-15 g DNA [62]。PCR与CL检测也被共同用来评估脐带血的母细胞污染[63]。一种核酸测序方法则是基于焦磷酸盐的释放和CL检测[64]。
场流分级法
场流分级法(FFF)作为一种细胞分拣的新技术,可以从复杂的自然基质中分离几少的特异性的活细胞[65]。FFF的诊断应用需要极为灵敏的BL/CL检测[66]。其进一步的应用还包括:同时分离发光细胞或通过遗传工程或使用BL/CL示踪物与细胞膜特异性结合而发光的细胞。
结束语
BL/CL检测已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具,适用于多种应用。现在,在很多生物技术领域,BL/CL已经作为一个优秀的基本检测原理得到应用,包括:报告基因技术,基因探针检测。当然,BL/CL技术还可以针对各种医学、制药和环境的目标分析物进行超灵敏检测,正好与目前高通量分析仪器的小型化,生物分析等趋势相吻合。新的BL/CL应用,例如BRET,基因融合,重组全细胞生物传感器和提内全动物成像等等也变得越来越普遍。
伴随着他们这些显著的优点,BL/CL技术同样也有一些缺陷。从实践的观点来看,BL/CL技术与传统的分光光度测定和荧光技术相比,更容易基质的影响。当然,BL/CL检测中的化学反应会被基质中的成分影响(通常是淬灭)。此外,酶或发光蛋白也和CL底物一样,相对荧光分子不稳定。另一个限制因素是,相比分光光度和荧光测量的仪器,BL/CL检测的仪器通常的实验室中此类仪器比较少,特别是需要高灵敏度检测时,所需要的仪器通常非常贵。
随着新的生物技术工具的不断产生,BL/CL将进一步得到发展。其中一部分是对新的BL报告基因的发现、克隆和测序,进而推动多重标记系统的研究。另一部分,分子、突变体或者组织发射红光或
近红外光谱,连同具有更高光子效率的CL系统,会成为有力的工具。伴随着小型化、高分辨率、超灵敏度,可同时检测不同发光探针的彩色CCD等技术在检测仪器上的应用,BL/CL应用技术将得到进一步发展。BL/CL结合上其他的发光反应,例如荧光和热发光或photoacustic发光可以进行更为有趣的应用。