实验原理
本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此,蛋白质具有吸收紫外光的性质,其最大吸收峰位于280 nm附近(不同的蛋白质吸收波长略有差别)。在最大吸收波长处,吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。
仪器与试剂
紫外-可见分光光度计,比色管,吸量管
标准蛋白质溶液:5.00 mg.mL-1溶液,0.9% NaCl溶液,待测蛋白质溶液
实验步骤
1. 标准曲线的制作 :
用吸量管分别吸取1.0 、1.5、 2.0 、2.5 、3.0 mL 5.00 mg.mL-1标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中,用0.9% NaCl溶液稀释至刻度,摇匀。用1 cm石英比色皿,以0.9%NaCl溶液为参比,在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度A280,记录所得读数。
2. 样品测定:
取待测蛋白质溶液3 mL,按上述方法测定280 nm处的吸光度。平行测定三份。
数据处理
1. 以蛋白质浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2. 根据样品溶液的吸光度,从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
注意事项和问题
1. 紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比,有何缺点及优点?
2. 若样品中含有核酸类杂质,应如何校正?