主题：【资料】多维色谱技术(45讲 待续)

色谱联用技术（2）

                  第一章  总论

1．1 前言（续）

    Jorgenson and Lukacs 于 1981年发现细内径毛细管适合于电驱动分离问题，因为高表面积对容积比可以解决热的散失[1]。1981 年 Lee , Novotny 和同事们发明了毛细管超临界流体色谱（SFC），也是使用了熔融石英毛细管[2]。
    但是液相色谱是另外一种情况，主要是因为在液相里扩散要慢的多，在开管柱中直径要很小，但是内径太小又不实际，但是另一方面使用小颗粒键合有机基团硅胶的填充柱可以大大提高柱效，而且制备这种填料的工艺也由 Horvath[3]和 Kirkland[4] 的先驱性工作解决了。
因而使高效能HPLC 得以实现。即使这样，在一般压力和不同的分离原理下其理论塔板数也受到限制，两个具有保留因子 k1,k2 化合物的分离度用下式表示：


式中，选择因子是 k2/k1 ，如果依靠柱效的提高而增加分离度，那就要大大加长色谱柱，因为 R∝ N1/2  即 N 提高四倍 R 才提高一倍。但是选择因子（α）有少许提高就会对 R 有很大的影响，所以选择性是提高分离度的主要手段，在HPLC中要通过改变固定相的各种基团实现分离。

[1] J. W. Jorgenson and K. D. Lukacs, ‘Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries,’Anal. Chem. 53: 1298 (198）
[2]  M. Novotny, S. R. Springston, P. A. Peaden, J. C. Fjeldsted and M. L. Lee, ‘Capillary supercritical fluid chromatography,’ Anal. Chem. 53: 407A (1981).）
[3] C. Horváth, W. Melander and I. Molnár, ‘Solvophobic interactions in liquid chromatography with non-polar stationary phases’, J. Chromatogr. 125: 129 (1976).
[4]  J. J. Kirkland, ‘High speed liquid-partition chromatography with chemically bonded organic stationary phases,’ J. Chromatogr. Sci. 9: 206 (1971)），


文献来源：L.MONDELLO, A.C. LEWIS, K. D. BARTLE,” Multidimensional Chromatography”,  John Wiley & Sons Ltd, 2002

色谱联用技术（3）

第一章  总论

1.2 填充毛细管柱和一体化色谱

    小内径填充柱的一个特点是使用小的体积流量（1-20μL）[1]，这样对环境有利，可以使用“特殊”（昂贵）的流动相，峰容积减小（表 1.1），这样可以分析难以得到的少量样品（皮摩尔），比如少量体液，或很少量的组合化学样品。
由于使用微柱数量的增加，使色谱趋于一体化，Giddings 是第一个指出在色谱分离模式上没有区别的人[2]。他们的分类只按流动相的物理状态来区分（GC，SFC或HPLC），但是它们的固定相都是小内径柱。到上世纪 80 年代这一概念得到提升，使用单一的色谱系统进行一系列色谱模式，即使用一台一体化色谱仪。这种仪器[3]用于分析石油的多种样品，见表1.2。

表1.1 用于分析色谱填充柱的比较


ODS=十八烷基硅胶
FID=火焰离子化检测器

文中有关的参考文献

[1] M. Novotny, ‘Recent advances in microcolumn liquid chromatography’, Anal. Chem. 60:500A (1988)
[2]  J. C. Giddings, Dynamics of Chromatography, Marcel Dekker, New York (1965)
[3]  D.Tong, K. D. Bartle, A. A. Clifford and R. E. Robinson, ‘Unified chromatograph for gas chromatography, supercritical fluid chromatography and micro-liquid chromatography,’Analyst 120: 2461 (1995)

文献来源：L.MONDELLO, A.C. LEWIS, K. D. BARTLE,” Multidimensional
Chromatography”, John Wiley & Sons Ltd, 2002

多维色谱技术（4）
                第一章  总论

1.2 填充毛细管柱和一体化色谱(续)

  Chester 曾提出一种流动相的相图区域的表示方法[1]，如图 1.1 所示，用于流动相参数的选择，而且区分不同方法的界线是可变的，在改变压力、温度和组成，溶质-流动相相互作用会有所变化，因此可以洗脱从永久性气体到离子化合物。溶质在流动相中的扩散系数与压力、温度、和流动相组成有关，也回影响溶质的传质过程，所以选择适当的流动相有重要的意义。


图 1.1 色谱流动相的相图（图中平面表示在温度恒定下改变压力和组成）

   
    普通色谱分离模式的范围如图1.1 所示，GC 和 HPLC 实践对应于图中的两个区域，SFC 使用单一流动相（这里指二氧化碳）使用相图的前端平面。但是，原则上讲除去双流动相（图 1.1 中的阴影部分）以外，任何一部分都可以使用。图 1.2 的微柱色谱图是使用二氧化碳混合物做流动相时同时使用图1.1 中前面所指定的条件，改变压力和组成得到的结果。


图 1.2 使用以下的条件得到的煤焦油色谱图
            色谱柱：Waters Spherisorb PAH5mm 30x2.5mm 石英毛细管柱
            柱温：100 ℃
            检测器：UV 254 nm
            流动相：在 30 min 内二氧化碳 100-300 bar
                    和甲醇从 0.10- 1.00 μL/min

[1]  T. L. Chester, ‘Chromatography from the mobile-phase perspective’, Anal. Chem. 69:165A (1997)）
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              多维色谱技术（5）
                        第一章  总论
1.2 填充毛细管柱和一体化色谱(续)

    下面表1.3 是使用讲座（4）图 1.1 中不同区域的流动相所进行的色谱。

表 1.3 使用流动相图（图1.1）不同区域的流动相



1.3 色谱系统的分离能力
  具有N个理论塔板数的单柱色谱，在保留窗口 t1-t2 中的峰容量，n，可以用下面的公式计算：
                                        (1.2)
通常使用的色谱分离方法的峰容量 n 数据列于表 1.4中。
表 1.4欧近代高效色谱的峰容量a
方法 柱长 理论塔板数 峰容量b
GC 50m 2×105 260
HPLC 25cm(5μm颗粒) 2.5×104 90
CEC 25cm(3μm颗粒) 6×104 140
50cm(3μm颗粒) 1.2×105 200
50cm(1.5μm颗粒) 2×105 260
a 使用公式 1.2 R=1 进行计算
b K=10

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      第一章  总论

1.3 色谱系统的分离能力（续）

      从前面表中数据可以看出即使很长的GC色谱柱或小颗粒的HPLC柱为了分离石油、天然产物或生物化学样品都不能满足分析的要求。例如一支用450m长的GC毛细管柱，具有1.3×106理论塔板数，有1000个峰容量，在11个小时内分离汽油仍然有相当多的重叠峰。在HPLC模式下或者使用电驱动的毛细管电泳，或高压单分散小颗粒填料的HPLC柱已在实际分析中使用，但是也不能完全分离复杂的实际样品。
      如果使用重叠的统计方法（SMO）处理，用一维色谱分析复杂混合物的限制性更为明显，近年 Jorgenson 及其同事和Bertsch 总结了 Davis 、 Giddings 和 Guiochon 的研究工作:说明什么样的色谱系统具有何种峰容量可以分离混合物组成的最大个数。因为峰是随机的而不是均匀分布的，所以一些峰的重叠是不可避免的，实际上使用 SMO 可以表示 n 对应于分离开的单一峰数目（s）和在实际混合物样品中组分的实际数目(m)的关系，可以用下式计算：

                    S=m exp(-2m/n)                        (1.3)

被分离峰的分数（s/m）可代表把一个组分分离为单一峰的概率，p，所以：

                      P=exp(-2m/n)                            (1.4)

对含有100个化合物的混合物，可以分离到 50–90% 所需要的峰容量（n）及对应的理论塔板数（N）见表 1.5。这样可以看出一维色谱的局限性。例如要用GC分离100个化合物超过80%，就需要使用内径为 0.25mm的毛细管柱 500m 柱长。要把 209 多氯联苯(PCBS)混合物分离到 80% 就要求107理论塔板数的色谱柱。

表 1.5 把100个组分分离到一定的分离峰分数时峰容量及其对应所需的理论塔板数



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                        第一章      总论
1.4 二维分离

    如果一个混合物进行垂直方向独立的两次分离，即在y轴和z轴成直角，那末响应的峰容量为 nz 和 ny，为了满足正交准则，两个方向的分离机制要不同，这样最大的峰容量就是nz 和 ny的乘积，nz × ny，（见图1.3）,分离能力有显著的提高。这样一来，如果第一支色谱柱的峰容量为 200，


图1.3  二维色谱的峰容量

第二支色谱柱为 50，在全二维气相色谱[（2D）GC]中可能得到104的峰容量，对一维色谱来讲就需要大约4×108 的柱效，即需要 80km 长 250μm 内径的色谱柱！使用峰容量为104 的全二维色谱柱，可以解决上述具有100个组分混合物分离出98个化合物来，原则上可以分离出 209 个 PCB 中的 200 个化合物。但是，如果两次分离色谱柱是同类型的，例如分离多环芳烃（PAHs）奈、菲和屈等，使用正相HPLC与非极性GC结合为二维色谱，分离效果比单独使用这些色谱柱没有什么改善，在二维色谱中的对角线保留数据图如图1.4 所示。但是，这一系统对分离烷基化多环芳烃很有利，在这两个分离过程的相关性很小（在HPLC中对多环芳烃母体的保留时间有很好的相似性，但是在GC中对多环芳烃母体可得到很好的分离）（见图1.4 ）


图 1.4  HPLC 的保留指数（log IL）和GC保留指数（log IG）对划图
  1——萘，2——2-甲基萘，3——2，3-二甲基萘，4——2，3，6-三甲基萘，5——联苯，6——芴，7——二苯塞酚，8——菲，9——2-甲基菲，10——3，6-二甲基菲，11——苯并[a]-菲，12——屈

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色谱联用技术（8）
                    第一章      总论 
1.4 二维分离(续)

      Giddings 指出（32）在整个分离过程中要把所有的化合物完全分离开，这种情况如图1.5 所示，这里有两支第二维色谱柱，分别取来自第一维色谱柱在△t 时段的流出物，在第二维色谱柱中进行再一次分离。


图 1.5 一根第一支色谱柱和两根第二支色谱柱的多维色谱系统

    偶合二维系统的峰容量决定于单柱的理论塔板数和△t，第一维色谱柱排除了在第二维色谱柱中会影响重要组分分离的干扰，如果△t大于第一维色谱柱的平均峰宽，它的效率就会受到影响，因为在第一维色谱柱中分离开的峰转入第二维色谱柱时又混在一起了。当△t增加时趋向于串联色谱柱，这样一来在前一支柱上的分离次序在第二支色谱柱中就消失了。
    二维色谱分离可以用平面床表示，就像平面色谱那样，组分用圆点来表示，实际上在二维色谱中由于谱带展宽致使圆点变为同心的椭圆型点，那么就会形成点的重叠，Bertsch(30)也阐明如何计算总的分离度 R, 用两个轴的Rz,Ry按照下面的公式进行计算：


（1.5）
如果两个轴上的分离度都大于1，那么最后的分离度也会大于1，这说明在二维色谱中组分的分离要比串联系统有更多机会得到分离，因为两个组分的两次相似的位移可能性小于单一柱。
    多维色谱技术很明显对分离复杂混合物具有明显的吸引力，研究了多种色谱技术的结合（图 1.6）。全二维色谱技术可以把第一支色谱柱中出来的组分快速地转移到第二支色谱柱中，可以它的接口是至关重要的，在全二维色谱的设计中要使从第一维柱中流出的组分，不可以在第二维柱中再混合起来，曾研究使用过各种多路阀的安排，使用某种装置可以使组分在色谱柱之间的转移十分有效，到目前为止，最好的例子是从第一支色谱柱用热调制方法使很少量样品进入第二支色谱柱。通常，基于化合物类型、分子质量、或挥发性等性质划分开的馏分从第一支色谱柱流出物进行中心切割，流到第二支色谱柱中进行进一步的分离，如果两支色谱柱使用相同的流动相，要靠压力的不同使组分转移，这一方法是Deans 等在1968年开发的，Davis 用于SFC 。如果流动相不同，要使用阀做接口，需要进行特殊安排以便排除大量的液体或超临界流体。在HPLC-GC 的连接中，可以使用保留间隙柱作预柱，可以把早出峰的溶剂排除，因而可以在HPLC流出的几百微升样品转入GC的色谱柱再进行分离。

多维色谱技术（9）

                            第一章      总论

1.5 多维色谱的起源

        多维色谱最早起源于平面色谱，在研究纸色谱（即把一条吸附有第二个液体（如水）的滤纸一端浸泡于含有样品的溶液中，靠毛细管的作用力使样品移动到滤纸上进行液-液分配），与其平行发展的是1944年 Martin 等开发的液-液分配色谱[1]，他们讨论了可以使用不同的洗脱剂在不同的方向上进行洗脱。Kirchner 等早在上世纪50年代首先研究了二维薄层色谱[2]，这一工作早于Stahl 对薄层色谱的基础性研究[3]。有各种色谱-电泳技术的联用，但是最重要的平面电泳分离是二维凝胶电泳，是O’Farrell于1975年报道的[4]，用这种方法，即一个方向使用等电聚焦，另一个方向使用十二烷激硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以从细菌培养液中分离出1000个蛋白质来，到目前二维凝胶电泳仍然用于蛋白质和DNA分离中。
   
      在过去20年的发展中，更多地研究适合于自动化和进行定量分析的多柱色谱柱系统，本书主要着重于这一方面，1978年发表的一篇二维GC [5]，近年有了更新[6]，并在1991年Liu 和 Phillips 对全二维GC进行的进一步的开发，Grob 开发并推进了HPLC-GC 的联用[7，8]。


[1]. R. Consden, A. H. Gordon and. A. J. P. Martin, ‘A partition chromatographic method using paper’, Biochem. J. 38: 224 (1944).
[2]. J. G. Kirchner, J. M. Miller and G. Keller, ‘Separation and identification of some terpenes by a new chromatographic technique’, Anal. Chem. 23: 420 (1951).
[3]. E. Stahl, ‘Thin-layer chromatography II. Standardisation, detection, documentation and application’, Chem. Ztg. 82: 323 (1958).
[4]. P. H. O’Farrell, ‘High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins’, J. Biol.Chem. 250: 4007 (1975).
[5]. W. Bertsch, ‘Methods in gas chromatography: two dimensional techniques’, J. High Resolut. Chromatogr. 1: 1, 85, 289 (1978).
[6]. W. Bertsch, ‘Two-dimensional gas chromatography: concept, instrumentation and applications–Part 1: fundamentals., conventional two-dimensional gas chromatography,selected applications’, J. High. Resolut. Chromatogr. 22: 647 (1999).

[7]. H. J. Cortes (Ed.), Multidimensional Chromatography. Techniques and Applications,Marcel Dekker, New York (1990).
[8] . U. A. Th Brinkman (Ed.), Hyphenation: Hype and Fascination, Elsevier, Amsterdam
(1999).Introduction 15


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            多维色谱技术（10）
        第2章  高效液相色谱与高效气相色谱联用

2.1 前言

      在目前的分离科学中复杂体系，如天然化合物、食品、环境污染物和矿物燃料的分析是十分重要的领域，最新色谱技术的发展出现了高效的分析系统，这一技术使用专用检测器以获得很高的选择性和灵敏度。

      有时，现有的单一色谱系统对复杂体系的分离能力尚欠不足，还需要使用多维色谱以获得更大程度的分离。

      在某些特殊情况下，把高效液相色谱和高效气相色谱结合在一起（HPLC-HRGC）就会体现出高选择性的HPLC和高效、高灵敏度HRGC的完美匹配，会得到比较高的峰容量，常常把LC和GC脱机相连，这样可以把液体方便地收集起来进行处理，但是这一方法费时费力，需要多步人工处理，有被污染的可能，会造成样品的损失。进行在线连接有许多好处：需要的样品两少；样品不会被污染；无须把样品蒸发或稀释；样品的前或后处理可以完全自动化。在线连接的缺点是：系统操作困难；初始设备费用高；接口比较复杂。LC-GC在线连接的主要问题是要解决大量的液体从LC转移到GC中，GC和LC之间的物理状态不同。研究了许多不同的方法，把大量溶剂从LC转移到GC色谱柱中，这些方法中要解决如何把溶剂除去的技术，而使被分析组分形成一个窄的谱带进入GC色谱柱进行分离。

2.2 转移技术

    这一章讲述如何把正相或反相HPLC的流出物直接转移到GC系统中的技术，概述一下要分析水性或含水HPLC流出物中组分的直接或间接转移的各种方法，实际上HPLC流出物的性质极大地影响转移方法的选择，以后要做详细的解释。图 2.1 总结蒸发HPLC流出物的方法，让大量LC流出物转移到气相色谱仪中。

LC流出物蒸发的方法

多维色谱技术（11）
      第2章  高效液相色谱与高效气相色谱联用

2.2 转移技术（续）
2.2.1保留间隙技术

    保留间隙方法[1, 2]是分析含有高挥发性样品定性和定量分析的最好的途径，这一方法的主要特点是在 $$lc 流出物沸点温度（适合的出口压力)以下把它转移到 gc 中，见图 2.2。这样使样品的蒸汽压低于进口载气的压力，并有如下两种结果：
•  由于溶剂效应挥发性组分又重新浓缩，这是溶剂捕集[3]
•  高沸点组分由于谱带在空间分散而展宽
在蒸发区域的前面形成一层凝聚的流出物，这一层凝聚物就像一层厚的起保留作用的固定相，这样它就阻碍所有大部分挥发性化合物进入色谱柱，所以，溶剂从样品层的后面向前面蒸发（见图 2.2）。这些效应使样品在未涂渍固定相的进样口得到浓缩。实际上，保留间隙是一个保留能力低于色谱柱的进口柱。保留间隙柱置于分析色谱柱的前面，保留间隙遵循另外的浓缩机制。在保留间隙柱中所发生的溶剂效应和其他效应叫做“浸出”。


图 2.2 柱头进样接口的示意图
              流出物离开HP$$lc 检测器进入阀的备用位置，多余的流到废液缸，
              当四通阀转换到进样位置时，流出物被泵送到柱头进样的转移管线，
              液体流在毛细管壁上，形成一层液膜可以保留溶质，蒸发从溶剂的
              后面开始，这样就使色谱谱带重新聚焦，转移完毕之后，关闭四通
              阀HP$$lc流出物再度流到废液缸。

    如果有大量溶剂使载气饱和，固定相回由于被溶剂膨润而变性（液膜比原来变厚），粘滞性或极性改变。结果会使色谱柱的保留能力增加，因而有利于大多数挥发性组分的保留。在蒸发的过程中，高沸点化合物会在空间形成谱带展宽，两种保留间隙效应能够使谱带重新紧缩，也就是相比聚焦和冷捕集，一般上人们叫它为固定相聚焦。相比聚焦是基于化合物通过保留间隙柱的速度高于通过分析柱的速度。再浓缩是基于预柱（保留间隙柱）和主要分析柱之间的保留能力之比，当溶质进入分析柱时产生冷捕集，这是因为分析柱的温度要保持很低使溶质不能移动，因而溶质聚集并浓缩一直到柱箱温度升高到足以使溶质移动流出色谱柱。

文献：
[1]. K. Grob, On-Line Coupled $$lc–gc, W. Bertsch, W. G. Jennings and P. Sandra (Series
Eds),Hüthig,Heidelberg,Germany (1991).
[2]. K. Grob, D. Frohlich, B. Schilling, H. P. Neukom and P. Nageli, ‘Coupling of highperformance liquid chromatography with capillary gas chromatography’,J. Chromatogr.295:55–61 (1991).
[3]. K. Grob, On-Column Injection in Capillary Gas Chromatography, W. Bertsch, W. G.Jennings and P. Sandra (Series Eds),Hüthig,Heidelberg,Germany (1991).

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