主题：【分享】高效液相色谱常见问题分析与对策

高效液相色谱常见问题分析与对策
液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A、峰拖尾
原 因
解决方法
1、筛板阻塞
a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱
2、色谱柱塌陷
填充色谱柱
3、干扰峰
a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱
4、流动相PH选择错误
调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰
5、样品与填料表面的溶化点发生反应
a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱
B、峰前延
原 因
解决方法
1、柱温低
升高柱温
2、样品溶剂选择不恰当
使用流动相作为样品溶剂
3、样品过载
降低样品含量
4、色谱柱损坏
见A1、A2
C、峰分叉
原 因
解决方法
1、保护柱或分析柱污染
取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相
改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。
D、峰变形
原 因
解决方法
1、样品过载
减少样品载量
E、早出的峰变形
原 因
解决方法
1、样品溶剂选择不恰当
a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂
F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原 因
解决方法
1、柱外效应
a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）
b、使用小体积的流通池
G、K’增加时，脱尾更严重
原 因
解决方法
1、二级保留效应，反相模式
a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d、更换一支柱子
2、二级保留效应，正相模式
a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法
3、二级保留效应，离子对
加入三乙胺（或碱性样品）
H、酸性或碱性化合物的峰拖尾
原 因
解决方法
1、缓冲不合适
a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液
I、额外的峰
原 因
解决方法
1、样品中有其他组份
正常
2、前一次进样的洗脱峰
a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速
3、空位或鬼峰
a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积
J、保留时间波动
原 因
解决方法
1、温控不当
调好柱温
2、流动相组分变化
防止变化（蒸发、反应等）
3、色谱柱没有平衡
在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
K、保留时间不断变化
原 因
解决方法
1、流速变化
重新设定流速
2、泵中有气泡
从泵中除去气泡
3、流动相选择不恰当
a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相
L、基线漂移
原 因
解决方法
1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）
控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图
2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）
使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体
用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化
更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时
用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
将波长调整至最大吸收波长处
M、基线噪音（规则的）
原 因
解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气
流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液
见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。
3、流动相混合不完全
用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）
减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备
断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。
6、泵振动
在系统中加入脉冲阻尼器
N、基线噪音（不规则的）
原 因
解决方法
1、漏液
见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶
选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题
断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。
5、系统内有气泡
用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡
清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）
用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池
8、检测器灯能量不足
更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞
更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置
O、宽峰
原 因
解决方法
1、流动相组成变化
重新制备新的流动相
2、流动相流速太低
调节流速
3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）
见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确
调整设定
5、柱外效应影响
a、 柱子过载b、检测器对反应时间或池体积响应过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大d、记录仪响应时间太长 5、 a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品b、 减少响应时间或使用更小的流通池c、 使用内径为0.007-0.01的短管路d、 减少响应时间
6、缓冲液浓度太低
增加浓度
7、保护柱污染或失效
更换保护柱
8、色谱柱污染或失效，塔板数较低
更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷
打开柱入口，填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低
提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大
使用较小的时间常数
P、分离度降低
原 因
解决方法
1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）
重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞图
去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
Q、所有的峰面积都太小
原 因
解决方法
1、检测器衰减设定过高
减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大
设定较小的时间常数
3、进样量太少
增大进样量
4、记录仪连接不当
使用正确的连接
R、所有的峰面积都太大
原 因
解决方法
1、检测器衰减设定过低
采取较大的衰减
2、进样过多
减少进样量
3、记录仪连接不正确
正确连接记录仪