主题：【极限体验&原创大赛参赛作品】一种未知小分子抗生素HPLC分析方法的建立（实验进度更新100109）

声明：我是新手，错误和疏漏之处请各位多多指教！因为要同时进行多项实验，以及受条件限制，更新的可能较慢，敬请见谅！由于不知道怎么上传图片，很多图片还得等学会了再传。因为涉及到保密，本贴会省略一些不必要的细节。感谢月旭工程师的宝贵建议和耐心指导！
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导读：
因为第一次发帖没经验，没有及时占用楼层，导致很多内容在后面，看起来不是很连续，幸亏版主使用“乾坤大挪移”征用了沙发了板凳，这里表示感谢！将来的补充多数会更新到前三层，如果未及时更新，请关注后面的帖子
本帖包括九部分内容：
一.背景
二.样品介绍
三.用到的色谱柱和色谱仪
四.曾经的思路（即作为一个新手的“蒙”）
五.咨询月旭工程师后的思路
六.同样流动相，两个色谱柱的比较
七.确定色谱柱，进行流动相的优化
八.峰纯度的检验（目前大概进行3/5，续文目前在50楼，写完会挪前面来）
九.找到的有用的参考文献（目前在15楼）
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一.背景
    我的研究课题是从发酵液中提取一种小分子抗生素，并得到其纯品。在这个过程中，想用高效液相色谱帮助指导分离，最终开发出用于测定发酵液效价的方法。要达到这个目的，首先要找到一种合适的分析方法，可以将目标组分与其它杂质分开，并优化到合适的保留时间和良好的峰型。这其中有一个很大的困难：没有目标组分的纯品，不了解其结构。在这种情况下，如何选着色谱柱？如何配比流动相？这一切都是摆在我这个新手面前的挑战。希望此贴能给像我一样刚开始接触HPLC的战友一些经验。
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二.样品介绍
    我的目标成分（发酵液中的活性成分）是一种小分子抗生素，到目前为止对它有以下了解：
      1.这是一种小分子物质
      2.这种物质极性很强，不溶于绝大多数有机溶剂
      3.这种物质在酸性条件下带正电荷，可能呈碱性   
    在进行高效液相分析之前，发酵液已经经过了预处理，并用大孔树脂、离子交换树脂等在生物显影的指导下进行了初步的分离纯化（事实上到这可能很多朋友都看出来了，这种物质在发酵液里，说明它溶于水的。可以用离子交换，就是能电离，那么一定极性不低。如果是行家，可能就不会像我傻乎乎的还用C18+甲醇水摸半个月条件了^-^ ）。用于上样的样品组成应该不是特别复杂，推测只有一个活性成分，另外活性成分和杂质应该极性都较强。
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三.用到的色谱柱和色谱仪
    1.某品牌C18柱，5μm，4.6×200mm
    2.极限C18-AQ，5μm，4.6×250mm（Ultimate柱试用体验）
    Agilent 1100 series，在线脱气机，手动进样器 VWD检测器
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四.曾经的思路
    我主修的专业和仪器分析相去甚远，也没有接触过HPLC，这次要完成这个任务，起初还是很盲目的。我们实验室有安捷伦1100高效液相色谱仪，配备手动进样器和VWD检测器。第一天站到这台机器面前，简直不知道从哪下手，哪个部分是干什么的也不清楚。于是就找到了当地的安捷伦销售（很幸运这销售是我校友），去图书馆借书，查资料，打安捷伦客服电话（这个客服真管用，态度好，讲解细，建议大家多打），请学校老师帮忙，总算是初步上手了。学会使用色谱仪后，就遇到了第一个问题，选择合适的色谱柱。
    如何针对我这个样品选色谱柱呢？说实话，当初看到品牌众多，编号各异的色谱柱时都蒙了，让我自己选是不可能了，于是找到了老师和卖色谱柱的工程师。打听了一大圈之后最终得到的建议是用一根C18柱（现在看这可能也是在蒙，是一种通用的做法，因为大部分的分析都是在C18上完成的），于是就买了某品牌C18色谱柱一根，装到色谱仪上，满心欢喜之时，遇到了第二个问题，选择流动相。
    说来惭愧，开始连流动相的概念和有机溶剂（比如乙腈）的概念都分不清。也是到处打听，最后买了乙腈和甲醇，选择了最常用的流动相：有机溶剂-水体系。
    这些都有了之后，便开始了尝试。如果要用一个词来总结这些尝试，那就是：失败。有强吸收的地方大多在死体积里。最后甚至用了纯水作为流动相（洗脱能力最弱），依然不能得到很好的效果，愁啊。
下图是用纯水做流动相得到的色谱图

乍一看图可能还是可以的，但比较分析之后发现我的目标组分应该是那个2.4分钟左右出峰的。对于一根200mm的柱子来说，这段可能处于死体积的边缘，干扰很多，对以后的定性定量都不利。所以彻底放弃了这种最常规简单的有机溶剂水体系，开始寻求别的办法。
另外想说说很多讲HPLC的书里带的方法开发流程图。因为我刚开始学习HPLC，见到书上的这个流程图时如获至宝，但是仔细一看却心灰意冷。对于一种未知物质，很难用这个图来开发。首先一个分子量大小就得我猜半天，然后是极性还是酸碱，都很难判断。更何况让一个没有经验的人看，这图本身就很难理解。所以我觉得对于新手，又是未知物质，还是先咨询下有经验的人，然后踏踏实实的慢慢开发，在这个过程中就会增长自己对HPLC的理解，找到合适的方法。（再想想如果是已知物质，那可能都有现成的方法，多查查文献就好了）。总之个人觉得那个图可能对于有经验的人更有意义。