主题：【原创】【第三届原创参赛】 薄层色谱在中药中的应用

一、薄层色谱的发展史概述


薄层色谱即将样品溶液用毛细管点在薄层板的一端，置密闭槽中，加入适宜溶剂为流动相。由于毛细管原理，溶剂被吸上，沿板移动，并带动样品中各组分向前移动，这个过程称为展开。由于各组分性质不同，移动距离不同，展开一定距离后，即得互相分离的组分斑点。可用适当方法使各组分在板上显示其位置，如组分本身有颜色，即可直接观察，否则可喷显色试剂或在紫外灯下观察荧光等办法确定斑点位置。

在1938年依斯迈洛夫（Izmailov）等人在试图将柱色谱的管柱内径缩小到1毫米，从而建立一种“微柱色谱”的工作失败以后，考虑到一种开放式的微柱色谱法。这种方法是在涂有氧化铝薄层的玻璃板上分离药用植物提取液内的生物碱。当时仅用几滴样品溶液，因此称之为“点滴色谱”。继后，人们用这一方法成功地进行了萜、烯等植物挥发油的分离，这一方法才有所发展，被称为“带色谱法”或“板色谱法”。

五十年代初，克尔希内（Kirehner）发展了依斯迈洛夫的方法，［7］但目前广泛使用遥薄层色谱技术，应归功于斯塔尔的工作。他在研究植物细胞组成的过程中，探索了高灵敏度的微量分离方法，详细地研究了以往的微量色谱技术，并将依斯迈洛夫提出的色谱方法中的仪器、吸附剂以及操作条件等标准化，使这一方法进一步发展成为一种新的色谱分析技术。斯塔尔称这种方法为“薄层色谱法”（简称TLC）。

二、原理
薄层色谱法是利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。根据固定相不同可以分为硅胶（G板、硅胶H板等）；聚酰胺；纤维素；离子交换剂；氧化铝等。薄层色谱在中药主要成份的鉴定中已得到普遍应用。

三、自制薄层板
1、材料准备：
（1）载板 除最常用的玻璃板外，还有铝箔及塑料板。一般的规格有5cm×20cm，10cm×20cm，20cm×20cm的规格。载板要求：化学惰性，厚度均匀、表面平整、光滑、洗净后不附水珠，晾干备用。
（2）粘合剂配置 ：不同浓度的CMC-Na常用粘合剂为。CMC-Na是一种高分子材料，因此，在溶解的过程，应该将称好的CMC-Na少量的撒在水的表面，让其自然沉降，这样能够充分浸润，使其溶胀之后可以加热溶解，如果不着急使用可以直接泡着不用加热直到溶解为止。在此需要注意的一点是：粘合剂用前一定要过滤，这样铺的板子才均匀，如果不过滤会因为一些肉眼看不到的不溶物混入，这样铺的板子会出现许多小颗粒；
（3）铺板 ：这一块比较简单，把粘合剂和固定相用的吸附剂按照一定的比例混合，向一个方向研磨，速度不宜快，要顺着研钵的边缘，仔细观察，一定要把气泡排除，稠度以用研棒粘取，成连珠状不成线状下滴为好；研匀后采用手铺或者铺板器铺制薄层板。
（4）干燥 ：铺好后的板子要到平面上晾干，否则难保证板面硅胶的厚度均匀用前再到105度活化30分钟

四、展开
1、点样  一般采用微升毛细管点样，也有自动点样器。在薄层板点样的斑点一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距的底边b(15～20 mm)，高效板一般基线距底边8～10 mm，圆点状直径一般不大于5mm，高效板一般不大于3 mm；条带状宽度一般为5～10 mm。高效板条带宽度一般为4～8 mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。一般不少于8 mm，高效板供试品间隔不少于5 mm。
2、展开剂：一般选用一种或多种分析纯试剂按照体积比进行组合。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用。
选择展开剂的另一个依据是溶剂的极性大小。极性大的化合物需用极性大的展开剂，极性小的化合物需用极性小的展开剂。一般情况下，先选用单一展开剂如苯、氯仿、乙醇等，如发现样品个组分的Rf值较大，可改用或加入适量极性小的展开剂如石油醚等。反之，若样品的个Rf值较小，则可加入适量极性较大的展开剂展开，或在原来的溶剂中加入一定量极性较大的溶剂进行展层。在实际工作中，常用二种或三种溶剂的混合物作展开剂，这样更有利于调配展开剂的极性，改善分离效果。通常希望Rf值在0.2-0.7范围内。溶剂极性大小的次序是：石油醚 < 二硫化碳 < 四氯化碳 < 三氯乙烯 < 苯 < 二氯甲烷 < 氯仿 < 乙醚 < 乙酸乙酯 < 乙酸甲酯 < 丙酮 < 正丙醇 < 甲醇 < 水。

3、展开实验
展开缸  应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，底部应平整光滑，或有双槽。上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开缸。展开前如需要溶剂蒸气预预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30分钟，溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。

4、显色
（1）紫外灯256nm或365nm下检视
(2)通用显色剂：①硫酸常用的有四种溶液：硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5mol／L硫酸溶液与0.5-1.5mol／L硫酸铵溶液，喷后110oC烤15min，不同有机化合物显不同颜色。②0.5％碘的氯仿溶液 对很多化合物显黄棕色。③中性0.05％高锰酸钾溶液易还原性化合物在淡红背景上显黄色。④碱性高锰酸钾试剂还原性化合物在淡红色背景上显黄色。溶液I：1％高锰酸钾溶液；溶液Ⅱ：5％碳酸钠溶液；溶液I和溶液Ⅱ等量混合应用。 ⑤酸性高锰酸钾试剂喷1.6％高锰酸钾浓硫酸溶液(溶解时注意防止爆炸)，喷后薄层于180oC加热15～20min。⑥酸性重铬酸钾试剂喷5％重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150oC烤薄层。 ⑦5％磷钼酸乙醇溶液 喷后120oC烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。⑧铁氰化钾-三氯化铁试剂 还原性物质显蓝色，再喷2mol／L盐酸溶液，则蓝色加深。溶液I：1％铁氰化钾溶液；溶液Ⅱ：2％三氯化铁溶液；临用前将溶液I和溶液Ⅱ等量混合。

（3）专属显色剂
甾类
①香草醛／硫酸
检出物：甾体激素。
溶液：1％香草醛浓硫酸溶液。
方法：喷后于105℃加热5min。
②氯化锰
检出物：雌激素类。
溶液：氯化锰0.2g溶于含硫酸2ml的甲醇60ml中。
方法：喷后置紫外光(365nm)下观察。
③高氯酸
检出物：甾体激素。
溶液：5％高氯酸甲醇溶液。
方法：喷后于110oC加热5min，置紫外光(365nm)下观察。
④三氯化锑／乙酸
检出物：甾类与二萜类。
溶液：三氯化锑20g溶于乙酸20ml与氯仿60ml混合液中。
方法：喷后于100oC加热5min，紫外光长波下观察。
结果：二萜类斑点呈红黄-蓝紫色。
⑤对甲苯磺酸
检出物：甾族化合物、黄酮类与儿茶酸类。
溶液：20％本品的氯仿溶液。
方法：喷后于100oC加热数分钟，紫外光长波下观察。
结果：斑点呈荧光。
⑥氯磺酸／乙酸
检出物：三萜、甾醇与甾族化合物。
溶液：氯磺酸5ml在冷却下加乙酸l0ml溶解。
方法：喷后于130oC加热5～l0min，置紫外光长波下观察。
结果；斑点显荧光。
(11)糖类
①茴香胺、邻苯二酸试剂
检出物：碳氢化合物。
溶液：1.23g茴香胺及1.66g邻苯二酸于l00ml 95％乙醇中的溶液。
方法：喷雾或浸渍。
结果：己糖呈绿色、甲基戊糖呈黄绿色、戊糖呈紫色、糖醛酸呈棕色。
②四乙酸铅／2，7一二氯荧光素
检出物：甙类、酚类、糖酸类
溶液：I．2％四乙酸铅的冰醋酸溶液；Ⅱ．1％2，7一二氯荧光素乙醇溶液。
取溶液I、Ⅱ 各5ml混匀，用干燥的苯或甲苯稀释至200ml，试剂溶液只能稳定2h。
方法：浸板。
③邻氨基联苯／磷酸
检出物：糖类。
溶液：O.3g邻氨基联苯加85％磷酸5ml与乙醇95ml。
方法：喷板后llOoC加热15～20min。
结果：斑点呈褐色。
④苯胺／二苯胺／磷酸
检出物：还原糖。
溶液：4g二苯胺、4ml苯胺与20ml 85％磷酸共溶于200ml丙酮中。
方法：喷后于85℃加热l0min。
结果：产生各种颜色。1，4-己醛糖、低聚糖呈蓝色。
⑤双甲酮／磷酸
检出物：酮糖。
溶液：双甲酮(5，5-二甲基环己烷-1，3-二酮)10.3g溶于90ml乙醇与l0ml 85％磷酸中。
方法：喷板后于110oC加热15～20min。
结果：日光下观察，白色背景上呈黄色斑点，紫外光长波下呈蓝色荧光。
⑥联苯胺／三氯乙酸
检出物：糖类。
溶液：0.5g联苯胺溶于l0ml乙酸，再加10ml40％三氯乙酸水溶液，用乙醇稀释至l00ml。
方法：喷后置紫外光下照射15min。
结果：斑点呈灰棕-红褐色。
⑦对二甲氨基苯甲醛／乙酰丙酮
检出物：氨基糖类。
溶液：I. 5ml 50％氢氧化钾溶液与20ml乙醇混匀，取此溶液0.5ml，加乙酰丙酮0.5ml与正丁醇50ml的混合液l0ml，此两种溶液均需新鲜配制，临用前混合；
Ⅱ. 1g对二甲氨基苯甲醛溶于30ml乙醇中，再加30ml浓盐酸，需要时此溶液可用正丁醇180ml稀释。
方法：先喷I后于105oC加热5min，再喷Ⅱ，然后于90℃干燥5min。
结果：斑点呈红色。
黄酮类
①乙醇胺二苯硼酸盐
检出物：黄酮类。
溶液：I. 1％乙醇胺二苯硼酸盐的甲醇溶液；Ⅱ. 5％聚乙二醇的乙醇溶液。
方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ使荧光稳定，再在紫外光长波下照射2min。
结果：紫外灯下观察荧光。
②三氯化锑
检出物：黄酮类。
溶液：10％三氯化锑的氯仿溶液。
方法：喷板。
结果：紫外光长波下呈荧光。
③三氯化铝
检出物：黄酮类。
溶液：1％三氯化铝乙醇溶液。
方法：喷板。
结果：紫外光长波下显黄色荧光。
④Benedict(硫酸铜／枸橼酸钠)试剂
检出物：含邻二羟基的黄酮类及香豆精类。
溶液：1.73g 硫酸铜(CuS04•5H20)：17.3g 枸橼酸钠及10g 无水碳酸钠溶于水并稀释至1 00ml。
方法：喷板。
结果：紫外光长波下观察，含邻二羟基的化合物，斑点荧光减弱或猝灭

5、影响因素

（1）温度，一般情况下温度高RF值高，温度主要影响有机溶剂的蒸发程度，影响展缸中各蒸汽的比例温度影响含水展开剂中的有机溶剂的溶解度，改变了展开剂的比例

(2)湿度的影响，主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化

(3)展缸是否预饱和

        饱和                                                                  未饱和

（4）样品预处理的影响：中药成分复杂，因此在样品预处理时要根据具体情况进行除杂处理！