主题：【原创】【第三届原创大赛】HPLC法测定除瘟退热颗粒中黄芩苷的含量

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发表于：2010/12/03 22:45:56 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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HPLC法测定除瘟退热颗粒中黄芩苷的含量

摘要目的: 建立除瘟退热颗粒中黄芩苷的含量测定方法。方法: 采用HPLC 法, 色谱柱为Lichrospher C18柱（250mm×4.6mm，0.45μm）, 甲醇：2%冰醋酸溶液（50：50）为流动相, 检测波长为274 nm; 流速为1.0mL /m in, 柱温为室温。结果: 黄芩苷含量在0.194μɡ~1.164μɡ范围内线性关系良好, r=0.9995, 平均回收率为97.5%, RSD= 1.06%。结论: 本法操作简便、可靠, 可用于除瘟退热颗粒的质量控制。

关键词: 除瘟退热颗粒; HPLC; 黄芩苷

行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，通过飞沫经呼吸道感染，往往造成暴发、流行或大流行，暴发时有很高的发病率。对于流感的治疗，西药安全性较低，毒副作用比较严重，且容易造成对抗生素的滥用。而中药感冒药更安全有效。

除瘟退热颗粒是对传统中医古方进行改良加以研究，其处方源于《伤寒论》及《太平圣惠方》，经多年临床应用，总结临床经验而成方，临床应用表明该处方有显著抗病毒和增强免疫的作用，对治疗流感有非常好的疗效。本文对颗粒中黄芩苷的含量进行测定, 对其质量标准进行考察，为进一步更加深入的建立质量标准、进行质量控制提供理论依据，为其制剂的开发提供实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司) ; Agilent 8453 紫外分光光度计(美国安捷伦公司); LG16􀀂W 离心仪(北京医用离心机厂) ;RE-52AA 旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) ;AE100电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ; 色谱柱: Lichrospher C18柱（250mm×4.6mm，0.45μm)。

1.2 试药

黄芩苷对照品(购自中国药品生物制品检定所); 甲醇、乙腈为色谱纯(天津康科德公司) , 磷酸为分析纯; 除瘟退热颗粒(自制中试产品, 批号100201、100202、100203)。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择参照2010 年版中国药典一部黄芩中黄芩苷的测定条件[1]，

并通过测定黄芩苷的UV紫外光谱, 选择274 nm为测定波长。

2.2 溶液的制备

2.2.1 黄芩苷对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品0.0097g。置于50ml容量瓶中，加75%甲醇溶解，用微孔滤膜进行滤过即得（浓度为0.194mg/ml）。

2.2.2 供试品溶液的制备：取本颗粒充分研细后精密称取1.0086g，置于25ml容量瓶中，加50%甲醇适量溶解，超声处理20 min，放置至室温，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，用微孔滤膜过滤即得。

2.2.3 黄芩药材对照液的制备：取黄芩一定量，粉碎后称取1.0g，按制备供试品溶液的方法，制备黄芩药材对照液。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备：按提取、制备工艺制备不含黄芩的阴性颗粒样品研细成粉末，精密称取阴性样品1.0025ɡ，按制备供试品溶液的方法，制备阴性对照溶液。

2.3 色谱条件与系统适应性色谱柱为L ichrospher C18柱（250mm×4.6mm，0.45μm) ; 流动相为甲醇：2%冰醋酸溶液（50：50）; 检测波长为274 nm; 流速为1.0 mL /m in; 柱温为25; 理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于5 000。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10uL, 注入高效液相色谱仪进行测定。结果表明, 黄芩苷峰与其他峰分离度良好, 阴性无干扰。

对照品溶液

供试品溶液

黄芩药材对照液

阴性对照品溶液

2.4 线性关系的考察取制备的黄芩苷对照品溶液，精密量取5ml置于10ml容量瓶中，加入50%甲醇至刻度，摇匀，用0.45um的微孔滤膜过滤（浓度为0.097mg/ml），取一定体积的续滤液置于ep管中，分别精密吸取2、4、6、8、10、12μl在上述色谱条件下分别进样，测定峰面积，进行色谱测定。以峰面积为纵坐标，对照品浓度X（μɡ）为横坐标，绘制标准曲线.

标准曲线	相关系数	线性范围
Y=2641587.3343X-5 8848.4667	r=0.9995	0.194μɡ~1.164μɡ

结果表明,黄芩苷在进样量为0.194μɡ~1.164μɡ 范围内, 与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验精密吸取黄芩苷对照品溶液10mL, 按上述色谱条件重复进样5 次, 每次进样10 uL,, RSD 为0.82% , 表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验取除瘟退热颗粒(批号100201) 5份, 分别按2.2%项下方法制备供试品溶液, 测得黄芩苷的平均含量为8.49 mg /g, RSD为1.17%。

2.7 稳定性试验取2.6 项下的供试品溶液, 分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 uL, 结果黄芩苷峰面积的RSD 为1.34% ( n = 6 ), 表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验取已知含量的除瘟退热颗粒细粉(批号100201) 5 份, 每份约0.25 g, 精密称定, 分别精密加入黄芩苷对照品溶液1.5mL, 按∃ 2.2.2 项下方法制备供试品溶液, 在2.3 项色谱条件下测定, 结果平均回收率为97.5%, RSD为1.06% ( n = 5) 。

2.9 样品含量测定取颗粒粉末不同3批，按照 2.2.2 项下方法制备供试品溶液, 并按2.3 项下色谱条件测定, 结果见下表。

序号	1	2	3
含量（mg/g）	8.5488	8.5950	8.6125

3 讨论

3.1 采用高效液相色谱法测定除瘟退热颗粒中黄芩苷的含量，精密度高，专属性强，重现性好，可作为除温退热颗粒的含量测定方法。

3.2 通过以上实验对该颗粒剂考察了其质量标准，说明除瘟退热颗粒可以作为临床用药储备，可以用于流感的预防和治疗。

3．3 在实验中对黄芩苷进行含量测定的色谱条件摸索中，流动相为甲醇：2%冰醋酸溶液（50：50）时，虽然柱压较高，但待测成分与相邻峰得到很好分离，且峰面积较大，分离度较好，理论塔板数不低于5000。所以实验中选定其做为流动相。因中药浸膏容易吸湿，造成该颗粒具有吸湿性，所以在颗粒储存过程中一定要注意防潮的问题。

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