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主题：【原创】【极限体验】Ultimate XB-C18柱，分离之路有你，见证成长（11月份）

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发表于：2011/11/06 21:54:26 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被samanthalas设置为精华；
【发贴背景】
这个样品，在硅胶板上显示单一斑点。用液相分析，它主要含有三个成分：
成分一：保留时间5.43min，紫外吸收232、313nm
成分二：保留时间6.80min，紫外吸收222、263、343nm
成分三：保留时间6.80min，紫外被成分二掩盖


此次实验的目的是纯化成分三，从图中可以看出，成分三和成分二的保留时间几乎没有差异，因此，用制备液相来进行分离会具有相当大地难度（时间会很长，还未必能将它们“拖开”）。幸运的是，从紫外吸收来看，成分三和成分二明显属于不同的化合物结构类型，因此，也确定了此次实验的基本方案：采用凝胶柱色谱（Sephadex LH-20）进行分离纯化。

【凝胶柱色谱介绍】
Sephadex LH-20是众多分离填料的一种，也是目前应用最为广泛的填料之一。它分离的机理主要是分子筛作用，它对于不同类型地化合物、不同分子量大小的化合物，具有良好的分离效果。当然，在使用甲醇/水或乙腈/水系统地时候，它还具有反相的作用，这个只是提一下，因为我平时基本用不用这个反相作用。

【凝胶柱色谱过程】
凝胶开放柱，长约1.5m，内径约2cm。样品的溶解和洗脱过程均使用甲醇，整个柱色谱过程，一共分离得到20个流分，每个流分约10ml，对其中一些流分进行液相分析（主要凭经验和对自己样品的了解程度，如果不了解，可以采用间隔采样分析的方法）。本人一共分析了其中的6个流分，下面是三张比较典型的液相分析图。

【仪器试剂】
水：重蒸水
甲醇：色谱纯，天津大茂   
乙酸：分析纯，天津大茂     
HPLC：Waters 高效液相
Waters 996 DAD检测器
Waters Model 600 controller液 相 色 谱

【色谱条件】 
色谱柱：Ultimate XB-C18柱（5μm, 4.6x250mm）
流动相：60%甲醇/水（V：V）（上面那张总样不是60%分析的啊）
流速：1.0ml/min
柱温：室温（约25度）；
检测波长：全波长检测；
进样量：随意；

【色谱图】






【结果与讨论】
1. 凝胶是个好东西，实验室的人，很多人都说过这句话。有些样品，不该用制备液相就别用，累死累活还不一定有好结果。比如这个样，依我的经验，要是用液相，那就相当于是自找苦吃。有句话说得好：不要迷信制备液相，制备液相未必算得上传说。

2. 事实上，凝胶的第2-4个流分主要含有成分一；第5-6个流分主要含有成分2；第8-12个流分主要含有成分3（即目标化合物），特此补充。

3. 这个样品，依我的了解程度，大概是山柰酚芸香糖，属于经典的黄酮类成分，当然，请注意我的用词是“大概”。

4. 还是不得不说，Ultimate XB-C18的压力真的很低。一开始我用的50%的流动相，出峰时间太晚，其压力是某国外著名品牌的2/3左右。一般来说，用国外某品牌色谱柱，跑50%的流动相，流速绝对不敢打1.0ml/min，那是肯定要压力过高报警的。

5. Ultimate XB-C18柱，分离之路有你，见证成长。难道这个贴是广告？枪手？
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kaikaifeng
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2011/11/6 21:54:55 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
占楼备用。

最近原创大赛曝出丑闻：各种从期刊上面抄袭的文章得了不少奖
打假也是打得风风火火，表面繁荣，里头腐烂不堪

加上原始评分不公布，大赛组织方有根据个人喜好随意修改原创大赛结果的嫌疑
所以，谢谢部分人的好意，本人的贴子不管水平如何，为避免被潜规则，均不参与原创大赛

望大家也慎重，祝大家好运，特此说明

本人极限体验贴汇总：
使用Ultimate XB-C18柱分析某样品小记（5月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20110519/3314378/
四种不同C18色谱柱对京尼平苷检测结果的简单分析（6月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20110609/3355101/
使用Uitimate C18柱分析某酸性单环单萜苷元类化合物小记（6月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20110624/3380915/
Ultimate XB C18柱指认植物中喹宁酸类化合物（10月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20111004/3569148/
Ultimate XB C18柱，关键时刻，怎能没有？！（10月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20111009/3577005/
Ultimate XB-C18柱监测京尼平苷水解全过程（10月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20111022/3600437/Ultimate XB-C18柱全程监测某样品酶水解反应（10月份）
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Ultimate XB-C18柱考察某样在紫外下的稳定性（11月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20111102/3621305/
Ultimate XB-C18柱分析某样在酸碱下的复杂反应（11月份）
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20111105/3628762/
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2011/11/6 22:02:52 Last edit by kaikaifeng
yuduoling
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2011/11/6 22:29:15 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个枪手不太冷
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dahua1981
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2011/11/7 8:41:52 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
11份的第三篇了吧
厉害
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冷冷的冰雨
xy4585618
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2011/11/7 9:15:01 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主硅胶版上的图谱呢？
感觉这个峰形有点宽，还有点托
  薄层一个斑点，的这种现象在中药上是层出不穷！
薄层你要是做阴性实验的话应该可以减少薄层和液相图谱之间的差异
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2011/11/7 9:17:26 Last edit by xy4585618
冷冷的冰雨
xy4585618
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2011/11/7 9:19:43 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
不含成分3的那张图是不是，成分3和其他的峰重叠了？
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kaikaifeng
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2011/11/7 9:35:22 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 冷冷的冰雨(xy4585618) 发表:
楼主硅胶版上的图谱呢？
感觉这个峰形有点宽，还有点托
  薄层一个斑点，的这种现象在中药上是层出不穷！
薄层你要是做阴性实验的话应该可以减少薄层和液相图谱之间的差异


硅胶板是以前的，包括总样也是以前的
样品太多，最近才上的凝胶

薄层一个点，液相N多峰，这是中药上再正常不过的现象
我有一个样品，硅胶一个点，从中分离得到了10多个化合物
还有几个点，也是分到三四个化合物

薄层阴性什么实验那些就不扯了
我要它没有什么意义
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kaikaifeng
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2011/11/7 9:36:45 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 冷冷的冰雨(xy4585618) 发表:
不含成分3的那张图是不是，成分3和其他的峰重叠了？


可能性不大，因为这是DAD检测器，能看到紫外吸收的，呵呵
另外，重叠的话，也只可能是200多的紫外，能看出来
第一张原来分析的总样图就可以看到，有个“突出的包”
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fengmo4668
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2011/11/7 9:49:00 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
kaikaifeng，这两天就准备系统的学习你的大作，以期模仿，以期超越！！
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冷冷的冰雨
xy4585618
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2011/11/7 9:56:20 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
50%流动相
甲醇-水50：50粘度最大，但流速到1，压力也不应该报警
液相报警压力跟你设置有关，你可设置高一些大于300bar,4000psi或…………MPA
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kaikaifeng
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2011/11/7 10:06:00 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 冷冷的冰雨(xy4585618) 发表:
50%流动相
甲醇-水50：50粘度最大，但流速到1，压力也不应该报警
液相报警压力跟你设置有关，你可设置高一些大于300bar,4000psi或…………MPA


我们设的就是4000，这个最高值在一定范围内是可调的
我的言外之意是，用某国外知名品牌，用这个条件压力非常大
使用的时候，用1的流速，压力太大系统会报警

不至于这些细节都要一一描述吧，汗
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