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主题：【原创】【极限体验】Ultimate XB-C18柱，几多欢喜几多愁！！（11月份）

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发表于：2011/11/14 22:34:59 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被czj_1027设置为精华；
【实验背景】
  对于做植物提取分离的人而言，利用各种手段分离得到单体化合物（即通常所说的纯品），然后得用化学法或者NMR（最主要的手段）进行结构鉴定，再进行各种活性筛选及测试，这是一条基本的路子。
  这条路子，涉及的一个重要的环节就是化合物比对。分离得到的纯品多了，就要进行化合物比对。比对的目的，是避免将同一单体化合物多次进行NMR测试，这样会造成人力、物力和时间的浪费。
  是的，我分到了两个单体化合物，管它们叫A和B吧，因为结构我还没有确定，现在，我要将它们进行比对。以免浪费老板的money。

【仪器试剂】
水：重蒸水
甲醇：色谱纯，天津大茂 
氯仿：分析纯，凯信
甲醇：分析纯，凯信   
液相：Waters 高效液相，Waters 996 DAD检测器，Waters Model 600 controller[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱[/url]
手机：HTC野火，薄层图谱扫描

【薄层色谱条件】
硅胶GF254板（青岛海洋化工）：2*5cm
展开剂：氯仿/甲醇＝2/1

【液相色谱条件】 
色谱柱：Ultimate XB-C18柱（5μm, 4.6x250mm）、某国产品牌色谱柱（5μm, 4.6x250mm）
流动相：甲醇/水（V：V），40%（某国产品牌）、45%（Ultimate XB-C18柱）
流速：1.0ml/min
柱温：柱温箱30度
检测波长：全波长扫描
进样量：随意

【比对过程】
1. 正相TLC共薄层，如果Rf值不一样，为不同单体化合物；如果Rf相同，需要用HPLC进一步确认
2. 如果HPLC也显示单一峰形，基本可以说明是相同单体化合物；如果是非单一峰形，为不同单体化合物

【实验过程】
共薄层的意思，说白了就是三个点：A点、B点、AB点。从下图结果来看，正相上色谱行为一致。
展开剂：氯仿/甲醇＝2：1（右边为刚显色时拍的照，左边为显色30min后拍的照）


TLC显示单一斑点，不能证明他们就属于同一个单体化合物，需要用液相进一步确认。
我曾从一个斑点分离得到10多个单体化合物，呵呵，类似的样品很多。
最开始的时候用的是某国产品牌色谱柱，流动相为40%甲醇/水。
对A、B分别分析（11月5日分析），保留时间相差不大（11.59min、11.24min）。



保险起见，对他们进行合并进针，显示同一峰形。


由于此国产品牌色谱柱使用时间较长，柱效已经不能跟新柱子比了。
所以，即便显示单峰，我仍真心希望A、B不是同一个单体化合物。
于是没办法，再次启用Ultimate XB C18（45%甲醇/水）进行分析。
结果，几多欢喜几多愁！！！！！显示单一峰形！！！！！


【结果与讨论】
1. 不同时间分析的样品，即使是同样的流动相，同样的色谱柱，同样的温度，由于仪器的不稳定，相同样品的保留时间相差还是挺大的，比如某国产品牌分析的样品，11月5日分析的保留时间是11min多，今天分析的是10min左右，这个不稳定因素，给我增加了很多工作量。

2. 如果没有DAD检测器，工作量分增加很多，因为我还得跟其它类似化合物进行比对。有了DAD检测器，能清楚地了解化合物的紫外吸收情况，举个简单的例子，这里提到的A、B就不用跟黄酮类化合物比对了（黄酮一般是3个紫外吸收带）

3. 某国产品牌色谱柱对样品的保留比Ultimate XB C18弱，基本上，要高5%。比如，用某国产色谱柱40%分析时的出峰时间，跟Ultimate XB C18用45%分析的出峰时间差不多。

4. Ultimate XB C18的柱效，虽然没有具体算出来，但是从图上可以看出，很高。

5. 为什么是几多欢喜几多愁？我庆幸的是，A、B是同一个东西，我没有浪费（测NMR很贵的）；我也很郁闷，因为A、B是同一个东西，我又少了一个化合物！！！
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kaikaifeng
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2011/11/14 22:35:12 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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dahua1981
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2011/11/15 8:54:31 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
开开的又一力作
值得期待啊
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dahua1981
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2011/11/15 9:05:17 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这下又跟着kaikai沾光了
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雪妖
czj_1027
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2011/11/15 9:09:36 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
恭喜kaikai的杰作

有几个问题，保留时间的在不同日期的漂移，有可能是流动相配置之间的差异，这可能不是你关心的事情，这种并不一定就是柱子的问题

有个问题请教一下，你用NMR都定性是单一物质了，难道还有在LC上分离出不同的物质吗？
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kaikaifeng
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2011/11/15 10:39:28 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 雪妖(czj_1027) 发表:
恭喜kaikai的杰作

有几个问题，保留时间的在不同日期的漂移，有可能是流动相配置之间的差异，这可能不是你关心的事情，这种并不一定就是柱子的问题

有个问题请教一下，你用NMR都定性是单一物质了，难道还有在LC上分离出不同的物质吗？


好的，现在对雪版主的问题一一解答

1. 哈，我没有说是柱子的问题啊，其实这事跟柱子基本没有关系，主要还是系统的问题。流动相的配制，我一般是按体积比来配的，跟温度也有一定关系。不过最应该考虑的是液相的问题

2. 没有用NMR定性啊，是确定AB不是同一化合物，才会去进行NMR测试的。不然就是我们所说的，打谱打重了，会被老板说的
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kaikaifeng
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2011/11/15 10:40:33 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
这下又跟着kaikai沾光了

沾啥光啊大华？
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samanthalas
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2011/11/15 12:37:56 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
啊！我想问的问题刚好被雪妖给问了。
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samanthalas
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2011/11/15 12:39:08 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
那个共薄层的图，三个点，从左至右，分别是A、B和AB吗？
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samanthalas
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2011/11/15 12:44:08 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 头像更新中，请稍候…(kaikaifeng) 发表:
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
这下又跟着kaikai沾光了

沾啥光啊大华？


哈哈哈，我想了半天，终于想明白了。应该指的是，雪妖给你加精的时候，给大华也加了分。
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kaikaifeng
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2011/11/15 13:21:28 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 samanthalas(samanthalas) 发表:
那个共薄层的图，三个点，从左至右，分别是A、B和AB吗？


从左到右分别是：A  AB  B
其实顺序不是特别重要
重要的是，要有AB这个点
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