主题：【第六届原创】一次“鬼迷心窍”的样品前处理开发过程

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fengmo4668

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发表于：2012/09/28 18:56:52 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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朋友们都还记得我检测β胡萝卜素的事儿吧，（不记的也没事，和这没什么关系），现在想说的，是开发β胡萝卜素检测的样品前处理时发生的事儿——一件鬼迷心窍的事儿。

我们的样品，是一个成分非常复杂的样品。有脂溶性原料，有水溶性原料，并且都不是一种两种，而是有几十种。

所以，要想准确检测β-胡萝卜素，色谱柱的分离效果是一个方面，前处理也是一个非常重要的步骤。

β-胡萝卜素为脂溶性物质，前处理的惯例是用有机溶剂把脂溶性物质萃取出来，然后选择合适的色谱条件进行分离检测。

前处理的好坏，直接影响了分析结果的优劣。好的前处理，干扰比较少，检测的时候，可能的影响因素就比较少一些；如果前处理不好，基体非常脏的话，分析就很有可能会有大麻烦。

因为本身样品中β胡萝卜素的含量不是很多，国标中的方法是要在遮光条件下萃取出来，在氮气的保护下旋蒸除去溶剂，然后再溶解纯化，最后在氮吹仪上浓缩定容。β胡萝卜素对很多条件敏感，比如光、热、氧气等等，而且我们也没有氮吹仪，纯化的过程中不可避免的会造成一定量的损失，所以，就想通过方法的改进，把前处理过程简化。通过减少操作步骤，尽可能的降低在前处理过程中的损失。

而判断前处理的好坏，除了看分层情况之外，还要看在色谱柱上的分离情况。本实验的色谱条件就是以前曾经报道过的方法。具体如下：

色谱柱： Ultimate^®Polar-RP；流动相：甲醇-乙腈（90:10）；流速：2ml/min
进样量： 10μL 检测波长： 448nm

因此，参考一些文献资料，按照时间顺序依次对样品进行了以下前处理的尝试。

尝试1. 取样品10ml，石油醚-丙酮混合溶剂20ml萃取。

这个是国标中关于食品中β胡萝卜素的前处理方法。但是对于我们的说，却是无法分层！猜测可能是我们的样品里含有几种含量较多、分子量很大的原料，他们吸收了有机溶剂形成了严重的溶胀，成为了胶体，从而影响了水相和有机相之间的分层。

尝试2. 我们的样品也要做脂肪含量，脂肪的提取也是用的萃取的方法，并且萃取的脂肪中带有β胡萝卜素带有的黄色，因此采取脂肪的方法前处理样品：取样品5ml，加碱，加10ml乙醇破乳，乙醚-石油醚混合溶剂（1:1）50ml萃取。

可以萃取，但是浓度特别低。必须想办法增加浓度才行。

尝试3.在尝试2的基础上，萃取溶剂的体积由50ml改变成20ml。

目标峰的峰面积大多了。但是分离的不太好。而且突然想到一个问题，就是破乳的10ml乙醇，是在水相存在，还是在有机相存在呢？？因为乙醇既有极性基团、又有非极性集团，和别的溶剂的互溶性又比较好，所以，都有可能。到底是如何呢？

尝试4. 不加乙醇。

与尝试3的图谱相比较，峰面积增大了很多（但不是倍数关系）。由此，基本可以判定乙醇存在于有机相部分。

如果是这样的话，我是不是可以再减少萃取溶剂的用量，从而得到浓度更大的萃取液呢？感觉是一个方向。

尝试5. 按照尝试3的方法，5ml乙醚-石油醚萃取。

这次麻烦了，无法正常分层了。3000rad/min的速率进行离心10min，无明显效果。最上层仅有少量液体，无色，且无法取样；中间层为胶体状物质，几乎无流动相；下层为水相。

直觉上认为是萃取溶剂太少的问题。但是却有一丝幻想，是不是换作别的溶剂，可以得到供试液呢？

尝试6,.用异辛烷、异丙醇、乙腈等等有机溶剂（常用溶剂）代替乙醚-石油醚来萃取。

依然无法分层！离心也不行。看来真的是萃取溶剂体积的问题了。
这样一来，辛苦了一圈，相当于又回到了原点！！

但是因为乙醚-石油醚的沸点太低了，太容易挥发了，导致同一个样品，两针的液相结果不平行，因此，就用沸点相对较高的异辛烷取代了萃取溶剂乙醚-石油醚。
最终确定的前处理方案为：加碱，加乙醇、乙醚-石油醚萃取，氮气保护下40℃浓缩，加异辛烷提取，滤液过0.22μm滤膜，即得供试液。而且在浓缩的过程中也可以观察到，40℃挥干乙醚和石油醚后，还有部分液体，经气味辨识，应该是乙醇。也回应了尝试4的试验结果。

这一番折腾的，真是鬼迷了心窍！

大家伙说说，我这样折腾，是纯粹在折腾吗？你怎么认为？