主题：【第六届原创】中药大黄化学成分提取分离经验心得

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发表于：2012/11/30 16:10:38 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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大黄中化学成分的提取分离

最近做了个中药成分提取分离的实验，跟大家分享一下，希望对大家能有所帮助。

实验器材

仪器：高效液相色谱仪：泵为LC-10AT VP (SHIMADZU, Japan)、检测器为SPD-10A VP UV/VIS detector (SHIMADZU, Japan)、色谱工作站为N2000(浙大智达，中国浙江)、分析柱为ODS柱（Dikma Technologies），玻璃板（2.5×7.5cm、10×10cm、20×20cm），色谱柱（24×40mm），冷凝管，圆底烧瓶（1000ml、500ml、50ml），移液管（5ml），水浴锅，层析缸（大、中、小），旋转蒸发仪（EYELA，Japan），天平，量筒（100ml、70ml），锥形瓶，铁架台（带铁夹），胶头滴管，试管若干等。

试剂及材料：薄层层析硅胶G，柱层析硅胶（100-140目、200-300目）和CMC-Na水溶液，石油醚，乙酸乙酯，甲醇，氯仿，丙酮，95%乙醇，冰乙酸。

HPLC流动相为：甲醇:水:磷酸=85:15:0.1

标准品（大黄酚、大黄素）

实验原理

大黄中的有效成分主要为蒽醌类成分，如大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素等（结构见图1），易溶于石油醚、丙酮、氯仿、乙醇等有机溶剂。本实验拟用95%乙醇对大黄原药材进行提取，所得提取物浓缩成浸膏，再根据各化合物的极性差别，以分析薄层色谱为指导，采用硅胶柱色谱对其进行砍段粗分，用制备薄层色谱进行细分，从而获取所需化合物，并对所得化合物进行纯度分析。

图1

实验方法与步骤

1.大黄化学成分的提取

20g大黄药材研碎 95%乙醇回流提取1小时旋蒸减压浓缩浸膏

2.大黄化学成分的分离

（1）分离条件的选择：

本实验设计拟先利用硅胶柱色谱对大黄浸膏样品进行粗砍段，故先摸索柱色谱分离条件。用TLC摸索并对比不同条件发现，在石油醚:丙酮不同比例条件下，样品中部分成分在薄层色谱下分离的比较好，且随着石油醚与丙酮比例的不同其Rf值会随着极性的增大而不同，在石油醚:丙酮=30:1的条件下样品能够初步得到分离，且在纯丙酮的条件下，几乎所有成分可以被展开到溶剂前沿，故本实验选用石油醚:丙酮=30:1的色谱条件开始洗脱，并用丙酮冲柱结束。

（2）硅胶柱色谱分离：

取1.5g样品浸膏用少量溶剂溶解加3.0g拌样硅胶干法拌样 25.0g分离硅胶湿法装柱样品溶剂挥干后干法上样石油醚:丙酮梯度洗脱（30:1，10:1，1:1，1:10，1:30，0:100） TLC指导合并流分

共得到68个小流分，薄层指导下合并流分，其中将流分1~8合并，标为Fraction 1（F1）；将流分9~16合并，标为Fraction 2（F2）；将流分17~21合并，标为Fraction 3（F3）；将流分22~25合并，标为Fraction 4（F4）；将流分26~32合并，标为Fraction 5（F5）；将流分33~68合并，标为Fraction 6（F6）。经TLC分析，F1在多种色谱条件下均为单一斑点，有些条件下有些许拖尾，故推测可能为单一化合物，准备上HPLC进行进一步分析；鉴于实验时间有限，准备选择极性较小的流分F2、F3上制备薄层进行进一步分离纯化。

（3）制备薄层分离纯化：

硅胶柱色谱下来的组分F2、F3进行制备薄层色谱分离。

经TLC分析发现，在石油醚:丙酮:酸=5:1:0.05的条件下，F2各部分能得到较好的分离，且成点性较好，故选用此条件对F2进行制备薄层分离：制备薄层硅胶板（20×20cm），点样后挥干溶剂，配好的展开剂放入层析缸中，将点好样的硅胶板同时放入进行饱和，30min后开始上行展开，得到的结果如图2所示。将图2中橙黄色条带刮下，并用甲醇冲洗得到F2-1；淡黄色条带刮下，并用甲醇冲洗得到F2-2。

经TLC分析发现，在石油醚:氯仿:丙酮:酸=2:1:1:0.05的条件下，F3各部分能得到较好的分离，且成点性较好，故选用此条件对F3进行制备薄层分离：制备薄层硅胶板（20×20cm），点样后挥干溶剂，配好的展开剂放入层析缸中，将点好样的硅胶板同时放入进行饱和，30min后开始上行展开，得到的结果如图3所示。将图3中橙黄色条带刮下，并用甲醇冲洗得到F3-1；粉色条带刮下，并用甲醇冲洗得到F3-2；黄色条带刮下（量最大），并用甲醇冲洗得到F3-4。

图3

3.大黄中化合物纯度的鉴别：

（1）TLC鉴别：将上述制备薄层制得的组分通过TLC方法检验纯度，同时选用三种以上不同的展开系统展开并观察薄层板情况，其中F2-1用三种展开系统（氯仿:乙酸乙酯=10:1，氯仿:丙酮=5:1，石油醚:乙酸乙酯=1:1）展开均为单一斑点，故推测可能为单一化合物，准备上HPLC进行进一步分析。F3-4用多种展开系统展开均为单一斑点，故推测可能为单一化合物，准备上HPLC进行进一步分析。

（2）通过分析HPLC鉴别：由于实验时间有限，故将以上柱色谱及薄层色谱下来的组分仅选择三个比较理想的组分进分析液相进行分析。其中F1为从硅胶柱色谱直接下来的馏分，F2-1和F3-4为薄层色谱制备所得到。

HPLC流动相为：甲醇:水:磷酸=85:15:0.1；检测波长为：254nm；流动相流速为：1ml/s。

五、实验结果

通过柱色谱和制备薄层色谱，从大黄浸膏中分离得到了6个化合物，对其中三个进行了纯度测定，TLC分析结果如图4所示：

HPLC分析结果：

组分F1出现保留时间分别为14.385min和21.153min的两个峰，纯度分别为62.0%和17.8%，故分析由于F1为仅通过硅胶柱色谱所得组分，虽然经TLC显示为单一斑点，但是这里分析显示为两个化合物，推测可能是两种极性十分接近的化合物，利用薄层色谱难以得到分离。但谱图显示两者是基线分离，故如果通过其他的手段如制备HPLC可以将其分开。通过和对照品比较推测F1可能主要为大黄酚和大黄素甲醚的混合物。

组分F2-1出现保留时间为11.095min的主峰，纯度为92.5%，分离纯化的较为理想，和对照品比较推测可能为大黄素。

组分F3-4出现保留时间为5.032min的主峰，纯度为90.6%，分离纯化的较为理想，和对照品比较推测可能为芦荟大黄素。

问题与讨论

1.由于实验时间有限，未能尝试更多的分离方法，如硅胶干柱法等，留待以后科研工作中进行尝试。

2.进行制备薄层色谱分离时，一定要等点的样品晾干后再行展开，否则溶解样品的溶剂极性会影响展开效果，从而可能致使分离效果不佳。

3.柱色谱和制备薄层色谱的优缺点分析：柱色谱能够分离的样品量大，但分离周期较长，分离效果较制备薄层色谱差一些；而制备薄层色谱由于受载样量限制，能够承载的样品量较少，但对某些特定样品分离较好，最大的优点是制备简单，速度快。

4.小的薄层板展开的效果与放大后的可能会有所不同，分析可能为展开距离不同所致。

5.用TLC进行化合物纯度分析时，即使三个以上的不同展开系统展开，看似是一个点，也不一定能确定其就是一个单一化合物，最好上HPLC进行进一步分析。

6.制备薄层色谱在刮取色带时，一定要坚持宁缺毋滥的原则，否则会影响所得化合物纯度。

综合上述问题，在以后的科研工作中，我们可以采用以柱色谱和制备薄层色谱相互配合的方法对样品进行分离纯化。在分离提取中，分离条件的摸索是十分重要的，选择好合适的分离条件对实验的成功与否有决定性的作用。在实验过程中，也要粗细结合，在合适的时候，可以加快实验的进度，例如粗分砍段时可以采用快速的色谱方法进行；而在有些时候必须细致小心，例如制备薄层色谱刮板或柱色谱合瓶时，此时须反复斟酌，否则可能前功尽弃。

总之，分离提取是一种需要理论指导，但同时动手能力也要求很高的实验，只有两方面都仔细学习，才能取得好的结果。通过这个实验，使我们对天然药物提取分离研究过程有了更深入的了解，希望这些对大家也有所帮助。

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