继”阿莫西林克拉维酸钾胶囊有关物质方法学”项目结束，整理的含量测定方法学。

项目：含量测定（3.2.P.5.2.9）

检查方法：照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定

试验条件：

仪器：LC-2010CHT (SHIMADZU)

万分之一电子天平（Sartorius ABS-124S型）

工作站（LCsolution色谱工作站)

色谱柱（填料：C₁₈，规格：250mm×4.6mm，填料粒径：5μm）

Xtimate C18 4.6*250 ，PN:Xt5B18425 ，SN:411101950

UV检测器（检测波长：220nm）

柱温：室温

流动相：0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）。

流速：1.0ml/min。

运行时间：约20分钟。

系统适用性：取阿莫西林克拉维酸系统适用性试验对照品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.8mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录的色谱图应与标准图谱一致。

具体试验操作：

取装量差异项下的内容物适量，精密称取适量，加水适量，超声使溶解并定量稀释制成每1ml中含阿莫西林0.5mg的溶液，滤过，立即精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另分别精密称取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含阿莫西林0.5mg和每1ml中含克拉维酸0.125mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C₁₆H₁₉N₃O₅S和C₈H₉NO₅的含量。

计算公式：

标示量百分含量（%）=××100%

式中：C_s为对照品的浓度（mg/ml）；

A_t为供试液的主峰面积；

N_t为供试液的稀释倍数；

A_S为对照品溶液的主峰面积；

W为供试品取样量（mg）。

“色”路蹒跚，藤下葡萄，某品种含量测定方法学之耐用性试验部分路蹒跚，藤下葡萄，某品种含量测定方法学之耐用性试验部分

3.2.P.5.3.6.1波长选择

本品含量测定检测波长参照中国药典2010年版二部收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准含量测定项，即220nm。

3.2.P.5.3.6.2流动相选择(色谱图见附件1122～1124)

参照中国药典2010年版二部收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准含量测定项，以0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）为流动相。

试验过程：

系统适用性试验供试液：精密称取阿莫西林克拉维酸钾系统适用性对照品4.2mg至5ml量瓶中，加流动相适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液；

对照品溶液：精密称取阿莫西林对照品29.1mg和克拉维酸钾对照品7.3mg至50ml量瓶中，加水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液；

精密量取上述供试液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，典型色谱图见下图：

3.2.P.5.3.6.3进样精密度试验(色谱图见附件1125～1130)

精密称取阿莫西林对照品0.0291g和克拉维酸对照品0.0073g，置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试液，取供试液20μl注入液相色谱仪，重复进针6次并记录色谱图。试验结果见下表。

精密度试验结果

进针次数	1	2	3	4	5	6	RSD%
阿莫西林保留时间（min）	11.580	11.581	11.581	11.582	11.569	11.569	0.05
阿莫西林峰面积	15577361	15534713	15555607	15571737	15570852	15570850	0.10
克拉维酸保留时间（min）	6.497	6.501	6.502	6.504	6.500	6.500	0.04
克拉维酸峰面积	5633160	5633461	5632872	5634096	5633504	5632704	0.01

试验结果表明，连续测量6次，主峰保留时间和峰面积RSD%均小于2.0%，进样精密度符合要求。

3.2.P.5.3.6.4含量测定线性关系试验(色谱图见附件1131～1135)

精密称取阿莫西林对照品0.0291g和克拉维酸对照品0.0073g，置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试液，分别精密量取12μl、16μl、20μl、24μl、28μl注入液相色谱仪并记录色谱图。试验结果见下表。

阿莫西林线性关系试验结果

百分比	60%	80%	100%	120%	140%
注入量（μg）	5.99	7.99	9.99	11.98	13.98
峰面积（A）	9346977	12432019	15562826	18616263	21723755

克拉维酸线性关系试验结果

百分比	60%	80%	100%	120%	140%
注入量（μg）	1.66	2.22	2.77	3.33	3.88
峰面积（A）	3388438	4500733	5625020	6722121	7829137

试验结果经线性回归分析，阿莫西林在5.99μg～13.98μg，直线方程为y=1548884.9368x+67468.0000，R²=1.0000，相关系数r=1.0000，截距为67468，小于100%阿莫西林峰面积的±2.0%（311257），表明线性关系试验符合要求；克拉维酸在1.66μg～3.88μg，直线方程为y=2000477.1001x+67767.2784，R²=1.0000，相关系数r=1.0000，，截距为67767，小于100%克拉维酸峰面积的±2.0%（112500），表明线性关系试验符合要求。

3.2.P.5.3.6.5溶液稳定性试验(色谱图见附件1136～1140)

取本品（规格：156.25mg，批号：20120401）细粉0.0502g，置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液在室温条件下放置8h，分别于0、2、4、6、8h精密量取上述溶液各20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。

溶液中阿莫西林稳定性试验结果

放置时间（h）/峰面积
0	2	4	6	8	平均值	RSD
15327048	15335390	15322633	15308883	15303426	15319476	0.09%

溶液中克拉维酸稳定性试验结果

放置时间（h）/峰面积
0	2	4	6	8	平均值	RSD
4753206	4755771	4745247	4736974	4729554	4741950	0.19%

本品供试液在室温条件下置8个小时，测得阿莫西林和克拉维酸的主峰面积的RSD%值均小于2.0%，试验结果表明阿莫西林和克拉维酸在水溶液中较稳定。

3.2.P.5.3.6.6回收率试验(色谱图见附件1141～1162)

按80%、100%、120%的份量，各精密称取阿莫西林和克拉维酸对照品三份，按处方量加入混合辅料约0.060g，混匀，分别用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，制成浓度各含阿莫西林约为0.40mg/ml、0.50mg/ml、0.60mg/ml的供试品溶液，精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。

阿莫西林回收率试验测定结果

标示量	对照品含量	加入量(g)	测得量(g)	回收率(%)	平均值（%）	RSD（%）
80%	工作对照品阿莫西林含量为69.2%，克拉维酸为17.8%	0.1122	0.0762	98.1	100.0	1.06
		0.1112	0.0775	100.7
		0.1117	0.0781	101.0
100%		0.1397	0.0962	99.5
		0.1402	0.0974	100.4
		0.1415	0.0972	99.3
120%		0.1662	0.1167	101.5
		0.1698	0.1165	99.1
		0.1686	0.1167	100.0

试验结果表明，平均回收率为100.0%，在98.0%～102.0%范围内，n=9，RSD为1.06%，小于2.0%，回收率符合含量测定方法验证要求。

克拉维酸回收率试验测定结果

标示量	对照品含量	加入量(g)	测得量(g)	回收率(%)	平均值（%）	RSD（%）
80%	工作对照品阿莫西林含量为69.2%，克拉维酸为17.8%	0.1122	0.0199	99.8	100.5	1.00
		0.1112	0.0200	101.0
		0.1117	0.0202	101.8
100%		0.1397	0.0249	100.1
		0.1402	0.0254	101.6
		0.1415	0.0251	99.8
120%		0.1662	0.0300	101.5
		0.1698	0.0299	98.9
		0.1686	0.0300	99.9

试验结果表明，平均回收率为100.5%，在98.0%～102.0%范围内，n=9，RSD为1.00%，小于2.0%，回收率符合含量测定方法验证要求。

3.2.P.5.3.6.7重复性试验(色谱图见附件1141～1144、1163～1174)

精密称取本品（规格：156.25mg，批号：20120401）细粉6份，分别置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过，制成每1ml含阿莫西林0.5mg的供试液，精密量取续滤液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。

重复性试验结果（%）

成分	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD
阿莫西林	99.3	99.6	99.9	100.0	100.5	100.1	99.9	0.4
克拉维酸	103.2	101.3	103.8	101.8	102.4	102.0	102.4	0.9

试验结果表明，重复性试验结果在99.3%～103.8%，RSD%值均小于1.0%，符合重复性试验要求。

3.2.P.5.3.6.8耐用性(色谱图见附件1175～1254)

耐用性研究项目	试验方法的条件	确认的耐用性范围
流速（活性成分的保留时间变化）	1.0ml/min	±0.2ml/min
pH值变化	4.4±0.1	3.9～4.9
流动相成分比例变化	甲醇比例为5%	2%～10%
检测波长变化	220nm	210nm～230nm
柱温变化	室温	20℃～30℃

申报质量标准中有关物质检查项色谱条件。

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）为流动相；检测波长为220nm。

（1）流速0.8ml/min～1.2ml/min，试验结果见下图表（色谱图见附件1175～1190）。

3.2.P.5.3.6.9含量测定方法的确定

根据含量方法学试验结果并参照新药转正标准第75册收载的阿莫西林克拉维酸钾胶囊质量标准WS₁-(X-024)-2007Z和中国药典2010年版二部收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准，确定本品含量测定方法如下：

照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定。

色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）为流动相；检测波长为220nm。取阿莫西林克拉维酸钾系统适用性试验对照品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.8mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录的色谱图应与标准图谱一致。

测定法 取装量差异项下的内容物适量，精密称取适量，加水适量，超声使溶解并定量稀释制成每1ml中含阿莫西林0.5mg的溶液，滤过，立即精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另分别精密称取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成与供试品溶液浓度相同的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C₁₆H₁₉N₃O₅S和C₈H₉NO₅的含量。