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毛细管电泳（CE）
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主题：【求助】待测蛋白的理论等电点和实际测定结果偏差多大？

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君and
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发表于：2014/05/29 09:50:05 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
求助：本人用贝克曼的PA 800plus毛细管电泳系统测定一个蛋白质的等电点，该蛋白质的理论等电点是5.1，我的测定结果是5.4。我用的试剂盒是贝克曼的Marker试剂盒，选用的三个Marker分别是7.0,5.5,4.1，用的尿素胶为4.5M，聚焦时间为17.5min，其他条件和贝克曼说明书相同，我想知道一般用毛细管电泳测定等电点偏差有多大？我这个偏差0.3有可能是什么原因造成的？我想做到偏差0.1。
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2014/5/29 10:54:13 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你多做几次，保证重复性就可以了，是什么样就是什么样。数据不会自己按照你自己的意思来。你的样品也可能存在偏差。拟合计算等电点的方法也会导致结果不同，但总体上结果差异不会太大。
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CEcret
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2014/5/29 11:03:32 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
个人有以下几点建议：
1。根据cIEF Beckman的方法，你用的Urea-cIEF Gel中Urea浓度应当为3M。聚焦时间应当为15min。首先建议你严格按照protocol来重现。
2。更高的Urea浓度会进一步增大gel的黏度及改变离子强度，对蛋白聚焦结果产生影响；更长的聚焦时间是没有必要的，10min其实就足够。你可以做的更快。
3。cIEF测定pI的精确度可以达到小数点后第2位。目前很多蛋白的参考pI都是采用gel IEF或者二维电泳做的，准确度不够高，也就是说实际测定过程中pI可能受到蛋白分子量影响，从而产生相对较大的偏差。我个人倾向于信任cIEF给出的结果
4。还有一种可能是你所测定的蛋白有几种不同型体，他们分别对应不同的pI，可能你所查询的参考pI是另外一个型体的。
能否告知你所测定的蛋白是什么名字？
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2014/5/29 11:19:55 Last edit by v2812644
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2014/5/29 12:21:17 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 CEcret(v2812644) 发表:
个人有以下几点建议：
1。根据cIEF Beckman的方法，你用的Urea-cIEF Gel中Urea浓度应当为3M。聚焦时间应当为15min。首先建议你严格按照protocol来重现。
2。更高的Urea浓度会进一步增大gel的黏度及改变离子强度，对蛋白聚焦结果产生影响；更长的聚焦时间是没有必要的，10min其实就足够。你可以做的更快。
3。cIEF测定pI的精确度可以达到小数点后第2位。目前很多蛋白的参考pI都是采用gel IEF或者二维电泳做的，准确度不够高，也就是说实际测定过程中pI可能受到蛋白分子量影响，从而产生相对较大的偏差。我个人倾向于信任cIEF给出的结果
4。还有一种可能是你所测定的蛋白有几种不同型体，他们分别对应不同的pI，可能你所查询的参考pI是另外一个型体的。

能否告知你所测定的蛋白是什么名字？


嗯，谢谢啦！

1.  说明书上市3M尿素胶，15min聚焦时间。我按照说明书上说了12次，待测产物峰形重复性不好；换了条件4.5尿素胶和17.5min聚焦      时间之后，待测产物峰形重复性很好；

2.  我一直按照说明书上来做的，没有试过10min聚焦；

3.  我们的蛋白质存在不同型体，但是大部分是5.1的这个构型
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君and
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2014/5/29 12:28:14 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 wy20071722(wy20071722) 发表:

你多做几次，保证重复性就可以了，是什么样就是什么样。数据不会自己按照你自己的意思来。你的样品也可能存在偏差。拟合计算等电点的方法也会导致结果不同，但总体上结果差异不会太大。


嗯，谢谢你，那一般情况下偏差能有多大呢？
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zyma_100
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2014/5/29 16:13:33 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
看一下几个MARKER的线性，和实际测定值
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CEcret
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2014/5/29 18:47:07 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 君and(v2762911) 发表:
原文由 wy20071722(wy20071722) 发表:

你多做几次，保证重复性就可以了，是什么样就是什么样。数据不会自己按照你自己的意思来。你的样品也可能存在偏差。拟合计算等电点的方法也会导致结果不同，但总体上结果差异不会太大。


嗯，谢谢你，那一般情况下偏差能有多大呢？


cIEF的应用属于自校正，也就是说每次分析的marker和蛋白的迁移时间即使有所不同，只要marker相对于其pI仍然呈良好的线性（一般都会有R2>0.999)，那么计算出来的蛋白pI总是差别很小的。一般最多在小数点后第二位有差别。

我私信你了，可以进一步交流。
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君and
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2014/5/30 9:05:35 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zyma_100(v2681763) 发表:

看一下几个MARKER的线性，和实际测定值


嗯，我选用了三个Marker，线性很好，均大于0.999。但是测定结果为5.4，理论值应为5.1，我们老师要求测定到5.2，也就是与理论值偏差在0.1
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zyma_100
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2014/6/18 11:41:16 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 君and(v2762911) 发表:
原文由 zyma_100(v2681763) 发表:

看一下几个MARKER的线性，和实际测定值


嗯，我选用了三个Marker，线性很好，均大于0.999。但是测定结果为5.4，理论值应为5.1，我们老师要求测定到5.2，也就是与理论值偏差在0.1


我的意思是Marker的实际测定值，比如加10的，看看实际测出来是几
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