主题：【第十届原创】2017饮料中着色剂草根比对实验记录（续）

            七月初参加了仪器信息网举办的饮料中柠檬黄日落黄的草根比对，8月初我们收到了举办方反馈回来的结果，如下
                 
      我们柠檬黄结果偏离了指定值很多。柠檬黄的结果为什么会出现这么大的偏离，是实验过程存在问题，还是数据处理问题? 我们初步怀疑是采用的254nm紫外光区检测波长存在干扰，因此再次向举办方申请样品，通过实验来查找问题所在。
      由于本次实验是与检科院的能力实验样品一起做，检科院的样品过于稠厚，无法固相萃取，所以我们做了一些改变
                1根据国标采用了聚酰胺粉吸附净化洗脱
                2洗脱液由乙醇-氨水-水改成氨水-甲醇溶液
                3检测波长除254nm外，增加检测波长430nm，480nm
    实验准备
          前处理用：
                  20%柠檬酸溶，实测PH=1.38
                  甲酸－甲醇液（体积比4+6）
                  氨水－甲醇（2%）：（200ml容量瓶放4ml浓氨水加甲醇定容至刻度），
                  PH=4水：100ml纯水加2滴20%的柠檬酸液，实测PH=3.30
                  PH=6水：直接用纯水，实测PH=6.02
                  聚酰胺粉，G3垂融漏斗
          流动相：
                  甲醇：Amethyst  Chemicals  HPLC/ACS
                  乙酸铵溶液：0.02mol/L，0.45μm滤膜抽滤后使用
        标准品
            中国计量科学研究院购买食用合成色素柠檬黄溶液标准物质（编号GBW(E)100001a），浓度为0.500 mg/mL，食用合成色素日落黄溶液标准物质（编号      GBW(E)100003a），浓度为0.500mg/mL
        标系配制
              1预实验配制20ug/mL的标准点进样，取样品过0.45μm滤头直接进样，粗略估计样品中目标组分含量范围，确定标准曲线的范围
              2取10mL比色管5个，加入柠檬黄标准溶液各0.1，0.2, 0.4 ,0.,6, 0.8mL纯水定容至10mL，
                              标准系列溶液  柠檬黄（μg/mL）5  10 20  30  40
      仪器与设备
            戴安液相色谱（P680 HPLC）  UVD170U紫外检测器
            VIS-1: 254nm  VIS-2 : 430nm  VIS-3: 480nm
            色谱柱：安捷伦柱  5μm  4.6*250mm
    样品前处理
            1. 根据样品中色素含量的高低，在千分之一电子天平上称样5-10g于50ml玻璃离心管，记录重量，然后称重1g聚酰胺粉用5ml水混匀后加入样品管，再用5ml水洗涤后一并加入，定容到25ml,每个样品管涡旋2min,静置1小时以上，再涡旋2min(如时间紧，可涡旋一次)

               
          2.将离心管中样品振摇混匀后，倾入G3垂融漏斗，尽量搅匀，使固形物均匀下沉形成厚度一致的聚酰胺层，便于除杂洗脱
               
        3. 聚酰胺混合液在垂融漏斗中静置沉降一会后，真空抽走液体，进入洗涤程序
              A：用pH＝4的水，每次10ml洗涤2次，5ml洗涤1次，可真空抽提
              B：用甲醇－甲酸溶液，每次10ml洗涤2次，5ml洗涤1次，可真空抽提
              C：用纯水洗涤，至流出液呈中性，每次10ml洗涤3次以上，可真空抽提
        4. 解吸  用2%的氨水甲醇液解吸，首次加入7ml解吸液，不要抽提，通过重力自然洗脱，收集于10ml比色管，尽量使聚酰胺层洗至无色，置氮吹仪吹净甲醇和氨，近干，加纯水定容至10ml待测

  液相色谱分析（进样20μL）

      1 标准曲线回归方程

           

	254nm	430nm	480nm
柠 檬 黄	ŷ=14.842x+5.420	ŷ=15.208x+5.929	ŷ=3.681x+2.255
	r=0.9998	r=0.9998	r=0.9999

2样品分析

		柠檬黄
		直接进样		聚酰胺粉净化
254nm	峰高	534.72	536.05	221.52	221.65
	结果(mg/kg)	70.16		28.62
430nm	峰高	244.91	243.76	227.38	227.51
	结果(mg/kg)	30.80		28.62
480nm	峰高	61.03	61.05	55.63	55.68
	结果(mg/kg)	31.38		28.50

      从数据可以看出，直接进样检测，结果是偏高的，特别是254nm处，聚酰胺粉净化后进样结果都在可接受范围
      注：样品指定值    柠檬黄(mg/kg)：28.3±1.41
  回收率

		柠檬黄
		样品		样品加标（10ug/ml）
254nm	峰高	197.28	197.58	344.36	343.36
	浓度(ug/mL)	12.93	12.95	22.84	22.77
	均值(ug/mL)	12.94		22.805
	回收率（%）	98.6
430nm	峰高	202.56	202.78	353.61	352.36
	浓度(ug/mL)	12.93	12.94	22.86	22.78
	均值(ug/mL)	12.935		22.82
	回收率（%）	98.8
480nm	峰高	49.49	49.73	85.83	85.64
	浓度(ug/mL)	12.83	12.90	22.70	22.65
	均值(ug/mL)	12.865		22.675
	回收率（%）	98.1

结果分析
      从结果来看，采用聚酰胺粉直接净化，柠檬黄在三个波长检测的结果一致，254nm波长处并未出现我们最初怀疑的紫外区的吸收干扰，这使我们感到困惑，第一次出现的结果偏高的原因在哪？
由于此次实验和上次相比，我们改变了一些条件，为了重现上次的实验过程，我们又重新采用6ml固相萃取柱作前处理，并分别采用两种解吸液解吸，验证不同的解吸液对实验结果的影响。
结果见下表

		柠檬黄		日落黄
		乙醇-氨水-水	氨水-甲醇	乙醇-氨水-水	氨水-甲醇
254nm	结果(mg/kg)	37.2	39.0	93.9	96.0
430nm	结果(mg/kg)	27.9	29.2	93.9	96.1
480nm	结果(mg/kg)	28.3	29.5	95.1	97.3

      对比实验数据发现采用固相萃取柱净化，柠檬黄在254nm处的检测结果明显偏高同时实验结果显示，两种解吸液在固相萃取柱上解吸，氨水-甲醇液解吸液的结果略高于乙醇-氨水-水的萃取结果，由于数据偏少，这个结论有待于更多的实验确认。

所有数据汇总如下表

	柠檬黄
		聚酰胺粉净化		固相萃取柱萃取
254nm	峰高	221.52	221.65	274.27	275.36
	浓度(ug/mL)	14.56	14.57	18.97	19.05
	结果(mg/kg)	28.6	28.6	37.12	37.28
430nm	峰高	227.38	227.51	221.87	224.01
	浓度(ug/mL)	14.56	14.57	14.83	14.98
	结果(mg/kg)	28.6	28.6	29.0	29.3
480nm	峰高	55.63	55.68	54.55	55.10
	浓度(ug/mL)	14.50	14.51	15.00	15.17
	结果(mg/kg)	28.5	28.5	29.4	29.7

      由此可以看出我们在七月初参加的饮料中草根对比试验中，采用固相萃取柱净化，并以254nm作为检测波长，色素柠檬黄检测结果确实会偏高。这种现象是这一品牌固相萃取柱特有的现象还是共同的现象，我们又对比做了另外一品牌固相萃取柱，结果如下：

		柠檬黄
		固相萃取柱（品牌A）		固相萃取柱（品牌B）
254nm	结果(mg/kg)	37.12	37.28	38.59	38.43
430nm	结果(mg/kg)	29.02	29.32	28.85	28.85
480nm	结果(mg/kg)	29.35	29.69	29.14	29.12

    从数据可以看出，采用固相萃取柱净化，柠檬黄在254nm处的检测结果会明显偏高，对此我们怀疑是不是固相萃取柱本身会带入在紫外区254nm处有吸收的物质影响检测结果，于是加做了全程含固相萃取柱净化流程的空白实验，品牌A和品牌B固相萃取后空白液254nm吸收谱图如下：   

      由上述谱图看出两种固相萃取柱空白解吸液在254nm处柠檬黄吸收值为零，也就是固相萃取柱本身并未带入254nm处有吸收的成分，那么样品中柠檬黄采用固相萃取净化，选择254nm测试结果偏高的到底是什么原因？此次实验仍未找到结论，只是发现样品中色素柠檬黄采用固相萃取净化，在254nm处检测存在很大风险

综上所述，针对样品中色素柠檬黄的检测，：一是可采用聚酰胺粉直接净化，二是采用430nm或480nm波长作测试波长。