主题:【分享】碱性磷酸酶的分离制备提取注意事项

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实验原理

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中,ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域,一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。

为了获得好的提取效果,在酶的制备过程,特别应注意以下几点:

(1)选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。

(2)用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时,要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细,需缓慢加入并及时搅拌溶解,尽量防止泡沫形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀,要静置20min以上,以使沉淀完全,然后方可时行离心分离。

(3)有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作,缓慢加入,充分搅拌,避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后,最好立即将其溶于适量缓冲液中,以避免酶活力的丧失。

(4)在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步聚才有效。

    酶活力的分析:通常是以对—硝基苯磷酸二纳(pNPP)为底物,在PH10.1的碳酸盐缓冲液(含2mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯( pNP)在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下,以5mmol/L pNPP为底物,在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L  Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。

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选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。
提取的更多一些
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在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。
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提取的更多一些
是的,效果要好很多
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在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。
是的
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