主题：【第十四届原创】HPLC测定水性乳液中异噻唑啉酮类杀菌剂

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万华宁波技师工作室发表于：2021/10/09 10:04:06 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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摘要

作者：王叶婷/张萌旭/朱湘鸿/庞一科

建立高效液相色谱法（HPLC）快速测定水性乳液中4种异噻唑啉酮类杀菌剂。[2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT),5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT)和1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)，2-甲基-1,2苯并异异噻唑啉-3-酮（MBIT）]。以甲醇作为萃取溶剂，用振荡提取和离心分离相结合的方法萃取试样中异噻唑啉酮生物杀伤剂。采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测,C18色谱柱分离，以保留时间定性，外标法定量。

关键词：水性乳液；异噻唑啉酮；高效液相色谱（HPLC）；杀菌剂；

2.背景介绍

水性树脂涂料是通过乳液聚合而成的含水乳胶，容易受到微生物的污染。在生产工艺中，为了保证我们的产品不受微生物的污染因为造成客户投诉，添加了异噻唑啉酮类的杀菌剂，起到杀菌防腐的作用。

在对标国标的情况下，相对于其他检测方法，高效液相色谱法具有高灵敏度、分离效果好，适合工厂大规模的检测。本文介绍了一种异噻唑啉酮杀菌剂的检测方法，能够协助生产装置快速的检测乳液中杀菌剂的检测工作。

3.具体开展工作

(1) 试验相关准备

1.1试剂与材料

除非另有规定，在测试中仅使用确认为分析纯及以上纯度的试剂和符合GB/T 6682要求的一级水。MIT、CMIT、BIT、MBIT等异噻唑啉酮类校准化合物。其中：

MIT 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，99%（质量分数）。

CMIT 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。

BIT 1,2-苯并异噻唑啉-3-酮，供应商aladdin，98%（质量分数）。

MBIT 2-甲基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮。供应商杜邦，98%（质量分数）。

卡松：供应商龙沙，1.54%，其中MIT，0.36% ，CMIT，1.18%（质量分数）。可从装置获取。

甲醇：HPLC级。

磷酸：含量大于等于85%（质量分数）。

氯化钙水溶液：10%

1.2仪器设备

a) 高效液相色谱仪：配有紫外检测器（UVD）或二极管阵列检测器（DAD）。配置反相色谱柱，能分离本方法中规定的异噻唑啉酮类化合物。

b) 分析天平：精度0.1 mg。

c) 旋涡振荡器或超声波提取仪。

d) 高速离心机：转速12000rpm，配有50mL规格离心管。

e) 容器：容量瓶25mL；离心管50 mL。

f) 活塞式移液枪。

g) 有机相微孔滤膜，0.22μm。

(2) 试验步骤

1.%2 液相色谱测定条件

a) 仪器及色谱柱：安捷伦LC1260，InertSustain C18反相柱，5.0μm，4.6mm×250 mm；

b) 柱温：35℃；

c) 流速：1.0 mL/min；

d) 进样量：20 ul；

e) 检测波长：MIT/CMIT 275 nm, BIT/MBIT 318 nm；

f) 流动相：流动相A:纯水，含0.1%磷酸；流动相B：甲醇；

g) 梯度淋洗程序：见表1

表1 梯度淋洗程序

时间/min	流动相A 0.1%磷酸水溶液%	流动相B 甲醇%
0.01	75	25
4	75	25
12	10	90
16	10	90
17	75	25
19	75	25
20	Stop

列于表A.1的参数已被证明对测试是合适的，由于测试结果取决于所使用的仪器，可根据不同仪器进行方法优化。

2.%2 标准溶液的配制

我们配制2条高低浓度的曲线，如下：

2.2.1 A标线：高浓度MIT，及BIT；母液A用于定性，标样A-1~A-5进行工作曲线的计算。

母液A：称取30mgMIT与50mgBIT与25mL容量瓶中，用50%的甲醇水溶液定容，超声溶解。标样A-1~A-5：使用移液枪分别移取0.03/0.05/0.10/0.30/0.60mL母液A与25mL容量瓶中，用50%的甲醇水溶液定容。

2.2.2 B标线：低浓度MIT，CMIT及MBIT。

B标线：低浓度MIT，CMIT及MBIT，母液B用于定性，标样B-1~B-5进行工作曲线的计算。

母液B：称取30mgMBIT与600mg卡松【1.54%，其中MIT，0.36% ，CMIT，1.18%（质量分数）】与25mL容量瓶中，用50%mL甲醇水定容。

具体配制数据如下：

母液A	化合物名称	MIT	BIT	50%甲醇水溶液稀释至ml
母液A	质量mg	31.1	51.7	25
母液B	化合物名称	MBIT	卡松（1.54%）	50%甲醇水溶液稀释至ml
母液B	质量mg	30.4	609.4	25

	标样A-1	标样A-2	标样A-3	标样A-4	标样A-5	50%甲醇水溶液稀释至ml
母液A/ml	0.03	0.05	0.10	0.30	0.50	25
	标样B-1	标样B-2	标样B-3	标样B-4	标样B-5	50%甲醇水溶液稀释至ml
母液B/ml	0.03	0.05	0.10	0.30	0.50	25

A曲线浓度（高）对应峰面积
化合物名称	母液浓度ug/ml	标样A-1	标样A-2	标样A-3	标样A-4	标样A-5
MIT	1231.56	1.48	2.46	4.93	14.78	29.56
MIT	1231.56	243668	326607	660048	1959116	4045978
BIT	2026.64	2.43	4.05	8.11	24.32	48.64
BIT	2026.64	242684	324881	655557	1942687	4016005
B曲线浓度（低）对应峰面积
化合物名称	母液浓度ug/ml	标样B-1	标样B-2	标样B-3	标样B-4	标样B-5
MIT	87	0.10	0.17	0.35	1.05	2.09
MIT	87	16838	28240	58529	176839	360138
CMIT	288	0.35	0.58	1.15	3.46	6.91
CMIT	288	35352	61275	126769	381342	774394
MBIT	1192	1.43	2.38	4.77	14.30	28.60
MBIT	1192	106292	179891	367968	1108472	2238240

每一种标准溶液重复进样两次，取峰面积平均值，其相对偏差应不大于5%，制作外标法标准曲线。

曲线线性如下：MIT：99.93%、CMIT：99.99%、BIT：99.95%、MBIT：99.99%

3.%2 样品前处理

称取均匀乳液样品2.5g（精确到1mg）于25mL容量瓶中，加入甲醇15mL，用振荡器振荡15-20S混匀后，加入2mL10%氯化钙水溶液，然后用甲醇定容至25mL，在离心机腔体温度不超过25℃的条件下离心25 min，至上层出现清液A。将清液A用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，保留滤液C，用于提取溶液的测定，进行高效液相色谱分析。

注：如离心效果不佳，不能有效分层，可适当增大转速或增加离心时间。

4.%2 化合物保留时间：见表2

表2 目标组分波长及保留时间

化合物名称	波长nm	保留时间/min
MIT	Ch1 275nm	4.14
CMIT	Ch1 275nm	9.667
BIT	Ch2 318nm	11.553
MBIT	Ch2 318nm	12.313

5.%2 色谱图

MIT、CMIT、MBIT的液相色谱图

（三）方法验证

3.1方法回收率

配置4个物质标准点进行验证，结果如下：

化合物名称	标准浓度(ug/ml)	仪器读数(ug/ml)	回收率（%）
BIT	23.3	22.8	98
MIT	1.1	1.2	109
CMIT	3.5	3.5	100
MBIT	13.9	13.5	97

各组分回收率均在95%-110%之间。

3.2 检出限

配置4个物质标准点进行检出限测定，见下图：

名称	检测波长nm	保留时间	外标ug/mL	峰高	噪音（阈值）	检出限ug/mL
MIT	275	3.827	1.08	28823	29.84	0.003
CMIT	275	9.223	3.58	56388	29.84	0.006
BIT	318	11.221	23.1	1832470	76.583	0.003
MBIT	318	11.987	13.97	1045292	76.583	0.003

3.3 重复性检验

对以下样品进行了重复性测定实验，进行了多次前处理并进样分析，见下图：

牌号	批号	序号	MIT（mg/kg）	CMIT（mg/kg）	MBIT（mg/kg）	BIT（mg/kg）
A	1	1	3.9	12.0	174.1	0.0
		2	3.9	11.9	170.0	0.0
		3	3.9	12.0	172.9	0.0
		4	4.0	12.0	176.0	0.0
		相对平均偏差（%）	1.0	0.3	1.0	—
B	2	1	3.8	11.8	182.9	0.0
		2	3.9	11.8	180.7	0.0
		3	3.8	11.8	181.2	0.0
		4	4.0	12.0	182.0	0.0
		相对平均偏差（%）	1.9	0.6	0.4	—
C	3	1	3.8	12.1	185.8	0.0
		2	3.9	12.3	187.1	0.0
		3	3.6	12.1	187.5	0.0
		4	3.9	12.2	185.8	0.0
		相对平均偏差（%）	2.6	0.6	0.4	—

数据分析如下：该类样品中只含有3种杀菌剂，其相对平均偏差均小于10%。

3.4 方法线性范围

由标准曲线得知，范围如下表：

曲线名称	化合物名称	测试范围（ug/ml）
高浓度曲线	MIT	1.48-29.56
高浓度曲线	BIT	2.43-48.64
低浓度曲线	MIT	0.10-2.10
	CMIT	0.35-6.91
	MBIT	1.43-28.60

3.5 结果计算

样品中每种异噻唑咻酮的含量以各自的质量分数 ω，计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按如下公式计算；

式中∶

[img]" style="max-width: 100%;max-height: 100%;[/img]——从标准工作曲线上读取的异噻唑咻酮的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）;

ν———试验溶液的定容体积，单位为毫升（mL）;

F————试验溶液的稀释因子;

m———样品的质量，单位为克（g）。

4.结论

本文建立了高效液相法测定水性乳液中的MIT、CMIT、MBIT、BIT四种杀菌剂的方法。样品中的杀菌剂经过振荡、离心以及溶剂的提取后，采用梯度淋洗，该方法灵敏度高、重复性好、回收率达到国标要求。可投入使用。

5.参考文档

［1］GB T 37363.1-2019 涂料中生物杀伤剂含量的测定第1部分：异噻唑啉酮含量的测定

文档号	参考资料名称/论文	原作者
1	近红外光谱仪器概况与进展[ J]. 现代科学仪器,1997(3):9 -11.	徐广通,袁洪福,陆婉珍
2	近红外光谱仪国内外现状与展望[ J]. 分析仪器,2007(4):1 -4.	褚小立,王艳斌,陆婉珍.