主题：【原创】【第三届原创大赛】光合细菌中辅酶Q10的含量测定

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19861005

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光合细菌中辅酶Q10的含量测定
【摘要】目的：建立了一种简单快速测定光合细菌中辅酶Q10(CoQ10)的方法；方法：运用高相液相色谱法测定；采取超声破碎细菌壁的方法（提取溶剂：丙酮）提取光合细菌中辅酶Q10；色谱柱为 ODS柱；以无水乙醇/甲醇(体积比70：30)作流动相；275 nm作检测波长。结果：在0.06—0.14 mg／L范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系(r= 0.9992)。结论：该方法简单、快速、精密度高(RSD<5％ )，适宜于光合细菌中辅酶Q10含量的测定。

【关键词】辅酶Q10；光合细菌

Determination of Coenzyme Q l0 in PSB

Student: Liu Zhao xi Supervisor: Yang guan e

【Abstract】Objective: A simple and rapid method for the determination of coenzyme Ql0 (CoQ10) in photosynthetic bacteria (PSB) was developed. Methods: high performance liquid chromatographic (HPLC) was developed; CoQ10 can be dissociated from PSB completely extracted into acetone with ultrasonic cel1-break method. Hypersil ODS was selected as the analytical column; absolute alcohol—methanol(1：9 by volume) as the mobile phase with flow-rate of 1.0m L／min; And UV 275 nm as the detection wavelength．Results: The 1inear range of the calibration curve of concentrations. peak height is 0.06—0.14 mg／mL with a correlation coefficient of 0.9992. Conclusion: This method is suitable for the determination of CoQl0 in PBS．

Keywords: Coenzyme Q10；Photosynthetic bacteria (PSB)

前言

一、光合细菌

光合细菌[1](Photosynthesis bacteria,简称PSB)是水圈微生物的一种,广泛分布在海洋、湖泊、江河、水田、污泥、土壤等各个角落,进行不产氧的光合作用而合成自身营养物质。光合细菌中含有丰富的营养成分^[2]，蛋白质含量在60％左右，还含有多种维生素，同时还含有大量的类胡萝卜素、辅酶Q10等生理活性物质，营养价值很高。

光合细菌作为一种营养丰富的光能自养菌,在人类生活的多方面都具有重要作用,并且已经在世界上许多国家得到广泛应用。近年来,随着细胞分子生物学的应用与发展,生物技术为中药研究提供了全新的思路,在中药开发中具有很大的优势与广阔的应用前景^[3]。

二、辅酶Q10(CoQ10)

辅酶Q10(CoQ10)又称癸烯醌、泛醌[4],为脂溶性醌类化合物,化学名称2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌，是一种脂溶性的类维生素物质，广泛存在于动物、植物、微生物的细胞内并与线粒体内膜相结合。CoQ10的生物活性主要来自其醌环的氧化还原特性及其侧链的理化性质(结构见图1)^[6]。CoQ10是细胞代谢和细胞呼吸的激活剂，具有天然的抗氧化活性，能保持膜质流动性并增强人体非特异性免疫功能。

目前，辅酶Q10作为多功能生化药物在临床上已有很多应用^[5]，如用于心血管疾病、急慢性病毒性肝炎、亚急性肝坏死、坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎、癌症、帕金森症等的治疗，均取得了一定的疗效。此外，由于辅酶Q10还能大幅度改善人体细胞的用氧功能、营养功能和免疫增强功能，能有效地深入皮肤，激发细胞活性，改善肤质，滋润肌肤，具有抗皮肤皱纹和延缓皮肤衰老的功效，因而也被广泛应用于食品添加剂、化妆品等领域。

最近几年调查显示^[7]，每年全球辅酶Q10的消费量达300多吨，其中功能食品的消费量约占60% 、药品消费约占20％、化妆品消费约占8％。我国对辅酶Q10的市场需求也在增加，预计到2010年，全球年需求量将达500吨，中国的年消费量将达60吨。所以辅酶Q10发展前景广阔，我国应该给予重视。

三、光合细菌中的辅酶Q10

光合细菌中含有辅酶Q10，有不少科研人员对其做过研究，并取得一定成果。本课题进一步证明了光合细菌中含有丰富辅酶Q10，对以后利用微生物发酵生产辅酶Q10有重大启示。因为利用微生物发酵生产CoQ10有几个基本优点^[8]:(1)发酵产物为天然品,生物活性好,易被人体吸收;(2)没有原材料的制约,可通过规模放大提高生产能力。因此,微生物生产CoQ10在工业化生产上更为看好。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

液相色谱系统(日本岛津公司)，配有LC-1OATvp泵、SPD-1OAvp检测器、LC -solution Lite色谱工作站；色谱柱ODSHYPERSIL C18 (10μm，4.6×250 mm) (大连伊利特分析仪器有限公司，中国大连)；有机系针筒式微孔滤膜；超速低温离心机(美国科俊仪器公司)；KQ-3200E型超声波清洗仪（昆山市超声波仪器有限责任公司）；CoQ10标准品(批量140611—200102，购自中国药品生物制品检定所)；甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂公司）；无水乙醇（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；丙酮（分析纯，南京化学试剂有限公司）；光合细菌。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

称取约10 mg CoQ10标准品，加入无水乙醇溶解并定容至25 mL，由275 nm处的吸光值(摩尔吸光系数 =14 600)测定其准确浓度，其浓度为0.4mg/mL,在避光条件下于冰箱中冷冻保存。

1.2.2 供试品溶液的配制

取光合细菌0.2g,放在100mL的离心杯里，然后加20mL的丙酮混匀，超声处理^[9]30min(T=18℃),离心5min(2500r/min)，取上清液。重复以上步骤做两次，合并上清液；用旋转蒸发仪蒸干（50℃），冷至室温，加无水乙醇溶解并定容到10ml容量瓶中，放入冰箱中待测。

1.2.3 色谱条件的选择

采用ODS色谱柱：HYPERSIL C18 (10μm，4.6×250 mm) (大连伊利特分析仪器有限公司，中国大连)；流动相：无水乙醇/甲醇(体积比70/30)；流速：1.0mL/min；柱温25℃；进样量：20µL；紫外检测波长：275 nm；

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂的选择

CoQ10是一种脂溶性的类维生素物质，因此需要一种极性小的溶剂来提取。本文比较了几种常见的有机溶剂，发现丙酮能定量萃取CoQ10，大大简化了CoQ10的提取过程。己烷、甲醇、乙腈因其极性太弱或太强，均不能将CoQ10从光合细菌中提取出来，其回收率几乎为零。

2.2 丙酮用量的最佳体积

光合细菌CoQ10的浓度较高，需要适合的萃取溶剂量。过多的萃取溶剂会造成CoQ10浓度的进一步稀释，萃取溶剂过少又不能保证CoQ10的定量萃取。本文比较了在不同体积情况下，CoQ10的萃取回收率变化，实验采用20 mL丙酮（重复三次）定量萃取光合细菌中的辅酶Q10较适宜。

2.3 流动相的选择

比较无水乙醇和甲醇在不同配比、不同流速情况下CoQ10的色谱行为时，发现当两者的体积比为70：30及流速为1．0 m L／min时，CoQ10 峰能很好地和干扰峰分离。

2.4色谱行为和系统适应性试验

在以上色谱条件下，量取供试品溶液和标准溶液各20ul，分别注入色谱仪，进行HPLC分析，结果见图-1和图-2。供试品图谱中在与标准品色谱图相应的位置上有相同保留时间的色谱峰。

图1-2：辅酶Q10对照品溶液的HPLC色谱图

图1-3：供试品溶液的HPLC色谱图

2.5 标准曲线的制备

精密吸取上述对照品1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL分别放入10mL的容量瓶中，用无水醇定容至刻度线。取标准系列溶液，依次进样，进样量为20uL，以辅酶Q10的进样量(浓度C)对响应值(峰面积A)进行线性回归，实验结果见表1．

样品 1 2 3 4 5

峰面积(A) 437629 552682 692930 827610 973700

回归方程为：y = 134707x + 292789，相关系数r=0.9992，线性范围为：60μg--140μg

2.6 精密度试验

取同一对照品溶液，重复进样5次，每次进样20µL，进行色谱分析，考察辅酶Q10响应值(峰面积A)的重现性。结果见表2

表2 方法的精密度

（Table 1 Precision of the method）

次数 1 2 3 4 5

峰面积 696931 718147 729479 719517 709761

根据公式可以得RSD％=1.7﹪＜2﹪，说明此方法精密度好。

2.7重复性试验

取同一样品，按照上述供试品的制备方法制备五份溶液，分别进样20µL，进行色谱分析，测定峰面积。计算RSD﹪为1.1﹪，说明此含量测定方法稳定，重复性好。

2.8 回收率实验

采用加样回收率法，取已知含量的同一批样品六份，精密称定，分别加入500µg的辅酶Q10对照品，按照“供试品溶液的配制”方法制备供试品溶液。经0.45µm的微孔滤膜过滤，分别进样20µL，进行色谱分析。实验结果见表3．

表3 辅酶Q的加样回收率实验

(Table 3 Results of recovery for CoQl0)

取样量（g）含有量（µg）加入量（µg）测得量（µg）回收率（﹪）

0.1004 502 500 993.3 98.26

0.1002 501 500 997.0 99.20

0.1000 500 500 995.5 99.10

0.1004 502 500 994.5 98.50

0.1004 502 500 992.7 98.40

0.1000 500 500 990.1 98.02

备注：平均回收率=98.54﹪，RSD﹪=0.51﹪，说明此方法准确度良好。

2.9 样品的含量测定

取三批样品（2批，3批，4批）各0.2g，按照“供试品溶液的制备”方法制备三份溶液，每次进样20µL，进行色谱分析，测定峰面积。结果见表4

取样量（g）辅酶10的含量（﹪）平均值（﹪）

0.2001 0.5089

0.2007 0.4887 0.4525

0.2012 0.3598

3.0 讨论

本课题采用高效液相色谱法测定光合细菌中的辅酶Q10，该方法方便快捷，结果可靠，在一定程度上为生物发酵产物中辅酶Q10的快速测定提供了一种新的方法。并且采用超声波破碎细胞壁提取的方法，与传统的提取法相比，超声波提取法具有提取速率快、提取效果好、提取率高、操作简单，且提取液中的杂质低等诸多优点，具有良好的应用前景。

参考文献：

[1]吉海平,李君.光合细菌应用动态[J].《生物工程进展》,1997,17(4):46~50

[2]陈福杰.光合细菌的性质和应用[J].生物学教学,2000,25(1):46~47

[3]揭晶,赵越.光合细菌应用的研究进展[J].广东药学报,2006,22(1):113~115

[4]张楠,曹玉成.辅酶Q10制备方法研究进展[J].榆林学院学报,2006,16(6):12~14

[5]吴祖芳,陈坚.辅酶Q10的功能研究进展[J].宁波大学学报,2001(6):85~89

[6]孙心齐,焦贺贤,王金中,程岚霞,余海侠.非极性流动相高效液相色谱法定量测定辅酶Q10[J].化学研究,2004,15(3):56~58

[7]辅酶Q10的现状与前景[J].制药原料及中间体信息,2007(1): 27~29

[8]刘正光,柏丽娟,卓文海,张瑞霞.辅酶Q10微生物发酵生产的研究进展[J].齐鲁药事,2006,25(11):675~677

[9]李聚海,岳田利,袁亚宏.辅酶Q10超声波破碎法提取工艺条件研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2007,35(5):207~211