主题：【第十二届原创】妇科止痒洗剂微生物限度检查方法适用性试验

                                                    妇科止痒洗剂微生物限度检查方法适用性试验
一、检验依据：《中国药典》2015年版四部1105、1106
二、仪器与实验材料
1、仪器 
      高压锅      型号：G154DW            致微（厦门）仪器有限公司
生物安全柜  型号：AC2-4S1                  新加坡艺思高公司
生化培养箱  型号：SHP-350                  上海精宏实验设备有限公司
生化培养箱  型号：LRH-250                  上海一恒科学仪器有限公司
天平        型号：LD3102                    沈阳龙腾电子有限公司
恒温水温箱  型号：S.HH.W21.600S 上海跃进医疗器械有限公司
2、样品         
品名：妇科止痒Ⅰ号洗剂          批号：20190221；20190315；20181211 
规格： 250ml/瓶                        生产单位：南平市人民医院
3、培养基
胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（批号:1901222）
沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）（批号:180925）
胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA）（批号:1901162）
沙氏葡蔔糖琼脂培养基（SDA）（批号:190116）
梭菌增菌培养基（批号:181213）
哥伦比亚琼脂培养基（批号:170914）
以上培养基均由北京三药科技有限公司提供；
溴化十六烷基三甲铵培养基（批号:20180403）由海博生物技术有限公司提供；
甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号:3104327）由广东环凯微生物科技有限公司提供。
4、菌种
枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】（第4代）
金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】（第4代）
铜绿假单胞菌【CMCC(B)10 104】（第4代）
白色念珠菌【CMCC（F）98001】（第3代）
黑曲霉【CMCC（F）98 003】（第3代）
大肠埃希菌【CMCC（B）44 102】（第5代）
生孢梭菌【CMCC（B）64 941】（第3代）
以上菌种均来源于广东环凯微生物科技有限公司。
三、菌液制备
1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时后，分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌的胰酪大豆胨液体培养基培养物1ml，用0.9％无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5～10-7，做活菌计数备用，选择适宜梯度使细菌数不大于100cfu/ml。
2、将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时，用0.9％无菌氯化钠溶液制成菌悬液或者孢子悬液，10倍稀释至10-3～10-5做活菌计数备用，选择适宜梯度使菌数不大于100cfu/ml。
3、接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，经20～25℃培养48～72小时取白色念珠菌液体培养物1ml，用0.9％无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-4～10-6做活菌计数备用，选择适宜梯度使菌数不大于100cfu/ml。
4、接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，经20～25℃培养7天，取黑曲霉新鲜培养物，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液用0.9%无菌氯化钠溶液进行10倍稀释至10-4～10-6，做活菌计数备用，选择适宜梯度使菌数不大于100 cfu/ml。
四、计数方法适用性试验
1、供试液制备 取10mL供试品，用胰酪大豆胨液体培养基稀释制成1：10的供试液，备用。
2、供试品中微生物的回收
试验组：取上述制备好的供试液，加入金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于100 cfu，取该混合液2ml（lml／皿），分别置直径为90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃相应的琼脂培养基。置规定温度、时间培养，观察计数结果。铜绿假单胞、桔草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉均依法操作。
供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
菌液组：取相应的稀释液代替供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
3.结果判断
计数方法适用性试验中，采用平皿法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。试验结果详见表1。

表1结果表明：按此方法进行适用性检查，所有试验菌的回收比值均小于0.5，试验菌的回收比值均不在0.5~2范围内，因此采用1：10的供试液重新进行适用性试验。

表2结果表明：按此方法进行适用性检查，所有试验菌的回收比值均在0.5～2范围内，故可采用制备1：10供试液按平皿法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
五、控制菌
1、铜绿假单胞菌
试验组：取1:10供试液10ml接种至100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，加入54cfu/ml的铜绿假单胞菌菌悬液1ml，混匀，30～35℃培养18～24小时，取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时，观察并记录。
阴性对照组：以稀释液代替供试液，不加试验菌，其他同试验组的控制菌检查。
阳性对照组：不加供试液，其他同试验组的控制菌检查。
供试品对照组：不加试验菌，其他同试验组的控制菌检查。

2、金黄色葡萄球菌
试验组：取1:10供试液10ml接种至100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，加入72 cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，混匀，30～35℃培养18～24小时，取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时，观察并记录。
阴性对照组：以稀释液代替供试液，不加试验菌，其他同试验组的控制菌检查。
阳性对照组：不加供试液，其他同试验组的控制菌检查。
供试品对照组：不加试验菌，其他同试验组的控制菌检查。

注：+代表沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有典型菌落生长，-代表沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上无典型菌落生长。
4、梭菌
试验组：取1:10供试液10ml，另取一份1:10供试液10ml置80℃保温10min后迅速冷却分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中，分别加入71cfu/ml生孢梭菌菌悬液1ml，混匀，置厌氧条件下30～35℃培养48小时。取上述培养物划线接种于哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下30～35℃培养48～72小时。
阴性对照组：以稀释液代替供试液，不加试验菌，其他同试验组的控制菌检查。
阳性对照组：不加供试液，其他同试验组的控制菌检查。
供试品对照组：不加试验菌，其他同试验组的控制菌检查。