主题：【原创】对昨天活动中提出的一个问题的回答---尿素的测定

今天比较忙,没有来得及做谱图,今还一直在想呢,其实标准溶液以及标准曲线好做,难就难在前处理上,现在我已经想了几种办法来做前处理,有时间试验试验

尿素氮的测定

BuN是体内aa.代谢的产物。衡量肾功能指标。
　　1、直接法：
　　　用特殊试剂与尿素直接作用，测定产物。
　　2、间接法：
　　　先用尿素酶将尿素转变为氨，再用不同方法测定氨可用血浆、血清。
　　　一、临床多用直接法——二乙酰——肟法  [实验]P97
　　　　　　　　　　　　H+　　
　　　　H2O+二乙酰-肟二乙酰+羟胺
　　　　二乙酰+尿素→二嗪化合物（粉红色）    540nm
　　1、可加Fe3+或铬离子可消除羟胺干扰。
　　2、反应并不专一。二乙酰-肟可与瓜aa.显色。但一般瓜aa. 含量少，可忽略不计。
　　3、简单、容易产生颜色稳定。可直接用血浆或血清测定，需加热，化学反应释放出一种臭味。
　　　参考值：5-19Mg/dL  （8-20Mg/dL）
　　　二、尿素酶法：
　　　　利用尿素酶催化尿素，生成铵盐，利用纳氏试剂直接显色。也可用标准酸滴定或用酚一次氯酸盐。
　　　　特点：反应专一，特异性强
　　　　操作费时，步骤多，试剂多。受体液中NH3的影响，用本法测含NH3较多的尿液时，须先用沸后去除尿液中NH3，并
　　　　用双蒸水配试剂，清洗溶器。
　　　　用血浆时不能用含F的抗凝剂，F可抑制尿素酶活性。
　　1、纳氏试剂显色法：（HgI、2KI）
　　　　血液中尿素养在尿素酶作用下，在中性或酸性环境下生成碳酸胺，在NaOH环境下生成Na2CO3和NH3、NH3与纳氏试
　　　　剂作用，生成棕黄色碘化双汞胺，可比色测定。
　　　　因为纳氏试剂所含Hg可对尿毒酶有影响，纳氏试剂酸、碱度不准确，显色后可有不显色或混浊现象。
　　2、酚一次氯酸盐显色法[实]P98
　　　　　　　　尿素酶　　
　　　　尿素+H2ONH3
　　　　　　　　　　　　　亚硝基铁氯化纳
　　　　NH3+酚一次氯酸盐　　　　对一醌氯亚胺
　　　　对一醌氯亚铵+酚→吲哚酚，碱性液中呈兰色
　　　　反应灵敏，血清用量少，不需沉淀蛋白。
　　3、酶联法：P159
　　　　　　　　尿素酶　　
　　　　尿素+H2ONH3
　　　　　　　　　　　　　　　谷氨酰脱氢酶
　　　　NH3+ α一酮戊二酸+NADH+H+谷aa.+NAD++H2O
　　　　　　　　　　　　　 340nm A　 ↓
　　4、干片法：
　　　　干片（1）多孔性展开层
　　　　　　（2）含尿素酶缓冲液的第一试剂层
　　　　　　（3）能透过NH3，但不能透过H2O的醋酸纤维素半透膜透过层（屏壁层）
　　　　　　（4）含NH3指示剂的第二试剂层
　　　　　　（5）透明支持体
　　　　　　　　每一层与每一层粘在一起，组合成片。
　　　　　　　　血NH3在干片上扩展，吸收，根据试剂层显色呈度，可求出不同标本BuN含量。
　　　　　　　　对测定肾功能、肾衰、尿毒症有意义
　　　　　　　　8-20Mg/dL  (5-19Mg/dL)  N
　　　　　　　　20-40Mg/dL  肾衰代偿期
　　　　　　　　> 40Mg/dL  肾衰失代偿期
　　　　　　　　>60Mg/dL 尿毒症期
　　　　　　　　肾移植患者每天测BuN，移植成功要监测Bu N，CO2结合率
　　2 肌酐的测定：
　　　　肌酐是肌酸代谢最终产物，是肌肉组织代谢产生。
　　　　仅被肾小球排泄，不被肾小管重吸收。
　　　　所以测血清肌酐浓度及肌酐清除率是测定肾小球滤过功能的重要指标。
　　　一、Jaffe反应法：[实验]P100
　　　　利用肌酐与碱性苦味酸生成红橙色化合物，称为Jaffe反应，这种反应可能是加成反应。在510nm下比色是测定
　　　　 Cn最常用方法。
　　　　有非特异的色素原干扰。干扰物有抗坏血酸， -酮酸、丙酮、乙酰乙酸、葡萄糖、蛋白质均可与碱性苦味酸反应
　　　　，又称假肌酐，假肌酐大量存在于RBC中。
　　　　所在不应用全血测定。
　　　　排除干扰方法：
　　1、漂白土（Faller试剂）吸附法：
　　　Faller试剂是一种硅酸铝土。
　　　可在酸性条件下吸附无蛋白血滤液中的Cr，经振摇，属心，Cr随漂白土沉淀，加入碱性苦味酸显色，可洗脱漂白土
　　　上的Cr。
　　2、阳离子交换树脂法：
　　　可除去溶血的干扰
　　　乙酰乙酸、抗坏血酸生理条件下可忽略不计，高浓度时，可对本法产生轻微影响。
　　　阳离子交换树脂装柱，可吸附血清或尿标本中的Cr而与干扰物分离，碱性苦味酸洗脱，显色。
　　3、二次读数法：
　　　利用肌酐苦味酸复合物与假肌酐物质与苦味酸复合物呈色差别的原理。
　　　加酸PH4时，真肌酐苦味酸复合物红色消褪，假肌酐苦味酸复合物红色稳定。
　　　对高浓度不敏感，对正常浓度效果较好。
　　　男0.9-1.5Mg/dL    女0.9-1.2Mg/dL
　　　二、酶联法：
　　　　　　　肌酐水合酶
　　　肌酐+H2O肌酸
　　　  　　　肌酸激酶
　　　肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP
　　　　　　　　　　　　　　丙酮酸激酶
　　　ADP+磷酸烯醇式丙酮酸辣丙酮酸+ADP
　　　　　　　　　　　LDH
　　　丙酮酸+NADH+H+乳酸+NAD+  340nm
　　　特异性高，标本不需除蛋白。特别适宜于全自动分析，需工具酶较多，价格昂贵。
　　　消除内源性Cr ADP干扰，做不加肌酐水合酶的对照。
　　　三、高效液相层析法
　　　主要用于肾疾病的测定
　　　Cr↑比BuN更可靠指标，反映肾小球功能指标。
　　3、肌酸的测定：
　　　与肌酐仅差一个水分子，测定方法同Cr。
　　　一、Jaffe反应法
　　　利用血浆或血清无蛋白滤液所含肌酸，在酸性环境下加热，脱水，形成Cr。测定脱水后Cr浓度，减去未用酸处理的
　　　样本中Cr浓度，所得数值乘以系数（1.16肌酸/肌酐）
　　　参考范围：男 0.17-0.5Mg/dL    女0.35-0.93Mg/dL
　　　二、酶联法
　　　同Cr，第一步不加肌酐水合酶
　　4、尿酸的测定：
　　　尿酸是核酸代谢中嘌呤代谢产物，是血浆非蛋白氮成份。
　　　原理：
　　1、在碱性环境中，尿酸具有还原性。可利用氧化一还原反应。
　　2、尿酸水解酶，使尿酸形成尿囊素和H2O2。
　　一、氧化-还源法：
　　　尿酸在氧化同时，有金属郭子化合价降低（还原为1价）。
　　1、特异性不高，易受谷胱甘肽，抗坏血酸、半胱氨酸、葡萄糖等还原物质影响。
　　2、显色速率不稳定，灵敏度低。
　　　（一）磷钨酸法：
　　　　1、Brown法：[实]P103
　　　　　尿酸+磷钨酸→尿囊素+CO2+钨蓝
　　　　　磷钨酸生色反应易有混浊现象，可切碱性试剂消除，且使反应颜色加深，多用氰化钠，但NaCN有剧毒。
　　　　　现多用Na2CO3代替NaCN消除混浊，呈色稳定，但灵敏度低。临床广泛采用。
　　　　　参考范围：男2.5-7Mg/dL        女1.5-6Mg/dL
　　　（二）杂菲铁法：
　　　　　酸性条件下，以三氯化铁为氧化剂，在尿酸被氧化的同时，高价铁被还原成低价。Fe2+与1，10-二氮杂菲形成
　　　　　复合物。在505nm处有最大吸收峰，颜色强度与尿酸含量成正比。反应快速，简便，不需除蛋白。线性范围宽，
　　　　　不受常规分析中遇到的还原物质的影响。
　　　　　VitC对本试验有干扰。
　　二、尿酸酶法：
　　　　　　　　　　尿酸酶
　　　　尿酸+O2+2H2O尿囊素+CO2+H2O2
　　　（一）紫外分光法：
　　　　　尿酸在282-292nm处有特异吸收峰。当其经过尿酸酶作用，产物在此波长范围内则无光吸收。所以测定酶作用前
　　　　　后吸光度之差值，可计算尿酸含量。
　　　（二）酶联比色法：
　　　　　　　　　　　尿酸酶
　　　　　尿酸+O2+2H2O尿囊素+CO2+H2O2
　　　　　　　　　　　　POD
　　　　　H2O2+MBTH+DMA偶氮色素+2H2O
　　　　　MBTH 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙
　　　　　DMA N，M-二甲基基胺
　　　　　偶氮色素600nm有吸收峰
　　　（三）酶联-紫外分光法：
　　　　　　　　　　　　尿酸酶
　　　　　尿酸＋2H2O＋O2尿囊素＋CO2＋H2O2
　　　　　　　　　　过氧化氢酶
　　　　　H2O2+乙醇乙醛+2H2O
　　　　　乙醛＋NAD+＋H2O → 乙酸＋NADH＋H+  340nm  A
　　　　　第一步特异，其后氧化-还原反应干扰因素多。体内有许多脱氢酶，使底物NAD+ →  NADH＋H＋，使测定结果偏
　　　　　高。

尿素的测定可参阅以下标准
GB2440-2001尿素
GB/T2441.1-2001尿素测定方法总氮含量的测定
GB/T2441.2-2001尿素测定方法缩二脲含量的测定分光光度法
GB/T2441.3-2001尿素测定方法水分的测定卡尔·费休法
GB/T2441.4-2001尿素测定方法铁含量的测定邻菲啰啉分光光度法
GB/T2441.5-2001尿素测定方法碱度的测定容量法
GB/T2441.6-2001尿素测定方法水不溶物含量的测定重量法
GB/T2441.7-2001尿素测定方法粒度的测定筛分法
GB/T2441.8-2001尿素测定方法硫酸盐含量的测定目视比浊法
GB/T2441.9-2001尿素测定方法亚甲基二脲含量的测定分光光度法

可以用二乙酰一肟在酸性条件下与基体中的尿素进行反应，我当时做的可以做到PPm,而且有基体的情况下，可以通过加标曲线法进行测定，线性三个九左右。

原文由 ylylttt 发表:
可以用二乙酰一肟在酸性条件下与基体中的尿素进行反应，我当时做的可以做到PPm,而且有基体的情况下，可以通过加标曲线法进行测定，线性三个九左右。

你做的什么样品,前处理怎么处理的,谢谢

好像中生公司使用NADP转化为NADPH，根据NADP的紫外吸收变化测定牛乳中尿素的含量。奶中含有一定的尿素的，大概尿素氮含量是11-25 mg/dL(可能是，记不清楚了)

原文由 ruojun 发表:
好像中生公司使用NADP转化为NADPH，根据NADP的紫外吸收变化测定牛乳中尿素的含量。奶中含有一定的尿素的，大概尿素氮含量是11-25 mg/dL(可能是，记不清楚了)

如果用nadp的话,那就在340纳米了,我之前也做过一个类似的试验,比较麻烦,需要很多酶的参与,不过干扰比较小,灵敏度也还可以.
  现在有专门的测定尿素的仪器呢

谢谢楼住了,很好的资料!

我做的是酒类，直接加样加热，样品加入量相对于总液体的量要很小，2％－5%左右，如果你做的样品杂质太复杂，建议你采用稀释降低样品基质的影响。

原文由 ylylttt 发表:
我做的是酒类，直接加样加热，样品加入量相对于总液体的量要很小，2％－5%左右，如果你做的样品杂质太复杂，建议你采用稀释降低样品基质的影响。

哦,我试一下,谢谢