主题：hplc的基础知识，常见问题，故障排除

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HPLC系统的酸清洗和钝化

30％磷酸水溶液通过酸反应和强表面活性剂／洗涤剂的共同作用，可以有效地清洁不锈钢及其它润湿的部件。这一方法比更常用的硝酸“钝化”绝对更有效、且较少损害(特别是对日常使用低紫外波长的应用来说)。这一磷酸清洗步骤不是起钝化作用，但它是系统钝化前清洗的第一步。一般来说，对于阳离子的离子色谱分析或配有氧化方式的电化学检测器以外的应用不需要钝化系统。因为有真空脱气机(每个通道体积为8m1)，可不必用磷酸；中洗全部通道。如果你计划四个通道都要用，则可用湿灌注的方式以4mL／min流速对每个通道清洗8～1 O分钟来清洗脱气机。这一步完成后你必须彻底淋洗管路，用水淋洗2～3次以便将磷酸从溶剂过滤头等部件冲洗净。
安装好的H P L C系统的酸清洗和钝化
HPLC系统内部可能的污染物来自人的触摸，暴露在实验室化学环境，与零部件制造相关的残留物，或来自先前的流动相和样品的残余物。
虽然系统自身也会逐步地被流动相清洗，但某些释放出的杂质会吸附在色谱柱上以及检测器润湿的表面上，因而会降低总的性能。
•磷酸清洗：
通常用于从系统中除去有机杂质。可能是由于洗涤作用，它似乎比强有机溶剂更好也更快。这一步清洗必须在硝酸钝化之前完成。
•硝酸钝化：
实际上是作用于不锈钢表面，在表面上生成均匀的氧化层。这层氧化膜保护不锈钢免受腐蚀(卤化物，螯合剂，等等)并且尽量减少浸出的金属离子进入流动相。
以下应用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸钝化，包括：
•所有的氨基酸分析系统
•所有包含电化学检测器的系统
•所有要分析无机阳离子，包括过渡金属的系统
•所有利用柱后添加衍生试剂或络合样品组分的系统
以下应用需要在使用前只做磷酸清洗，包括：
•所有常规用途的、可能在低pH环境下在低紫外检测波长下运行的HPLC系统
•所有需要高灵敏度性能的梯度紫外检测系统
系统清洗指南：
注意：在实行这个程序时采用适当的安全防护措施
准备工作：
首先，摘下色谱柱，用两通或接头取代色谱柱。在实行这一清洗步骤时，如果有可能选择监测的紫外波长为：254nm。通过软件或移去电缆的方式取消紫外检测器的自动回零功能。
具体步骤：
1、用甲醇彻底冲洗系统，以等比例方式通过泵的所有管路。
2、用水彻底冲洗系统，以等比例方式通过泵的所有管路。
3、以等比例方式通过泵的所有管路导入～30％v／v磷酸水溶液。以1mL/min流速洗大约一个小时。在冲洗期间活动所有的阀，包括：参比阀、进样阀及旁路阀等等。
4．用水彻底冲洗所有管路和系统。
必要时用6N硝酸(HN03)重复以上步骤。否则，跳到第7步。注意：硝酸是一个强紫外吸收溶液。除非绝对需要，不要做钝化程序
5．以等比例方式通过泵的所有管路导人6N硝酸水溶液(大约是40％)。以1mL/min流速洗大约一个小时。
6．用水彻底冲洗系统，仔细检查是否有任何渗漏，在冲洗期间反复活动所有的阀，包括：参比阀、进样阀及旁路阀等等。
注意：如果你要用低于270nm的紫外波长作检测，则需要更大量水的清洗过程，不断的换新鲜水并活动各个阀(冲洗进样器，等)以便从系统中除去所有的痕量硝酸根离子。硝酸清洗后经常在几天之内都会观察到在低紫外波长下有负的基线漂移。勤换水和有耐心是尽快消除紫外本底的关键。
7．返回到甲醇洗，然后继续用实验所需的溶剂冲洗。
8．通过软件或接上电缆的方式重新使紫外检测器的自动回零功能恢复。[

HPLC故障及排除方法
诊状          可能的原因              解 决 方 法
(一)保留时间变化    1.柱温变化    柱恒温
    2.等度与梯度间未能充分平衡    至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
    3.缓冲液容量不够             用>25mmol/L的缓冲液
    4.柱污染                     每天冲洗柱
    5.柱内条件变化             稳定进样条件,调节流动相
    6.柱快达到寿命             采用保护柱
(二)保留时间缩短    1.流速增加    检查泵,重新设定流速
    2.样品超载           降低样品量
    3.键合相流失           流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
    4.流动相组成变化           防止流动相蒸发或沉淀
    5.温度增加             柱恒温
(三)保留时间延长    1.流速下降    管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
    2.硅胶柱上活性点变化    用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
    3.键合相流失             同前(二)3
    4.流动相组成变化             同前(二)4
    5.温度降低             同前(二)5
(四)  出现肩峰或分叉   
        1.样品体积过大    用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
    2.样品溶剂过强           采用较弱的样品溶剂
    3.柱塌陷或形成短路通道    更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
    4.柱内烧结不锈钢失效    更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
    5.进样器损坏    更换进样器转子
(五)鬼峰    1.进样阀残余峰    每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
    2.样品中未知物    处理样品
    3.柱未平衡    重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
    4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)    每天新配,用抗氧化剂
    5.水污染(反相)    通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
(六)  基线噪声    1.气泡(尖锐峰)    流动相脱气,加柱后背压
    2.污染(随机噪声)    清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
    3.检测器灯连续噪声    更换氘灯
    4.电干扰(偶然噪声)    采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
    5.检测器中有气泡    流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾    1.柱超载    降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
    2.峰干扰    清洁样品,调整流动相
    3.硅羟基作用    加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
    4.同前(四)4    同前(四)4
    5.同前(四)3    5.同前(四)3
    6.死体积或柱外体积过大    连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
    7.柱效下降    用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽    1.进样体积过大    同(四)1
    2.在进样阀中造成峰扩展    进样前后排出气泡以降低扩散
    3.数据系统采样速率太慢    设定速率应是每峰大于10点
    4.检测器时间常数过大    设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
    5.流动相粘度过高    增加柱温,采用低粘度流动相
    6.检测池体积过大    用小体积池,卸下热交换器
    7.保留时间过长    等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
    8.柱外体积过大    将连接管径和连接管长度降至最小
    9.样品过载    进小浓度小体积样品

保留时间漂移的故障排除

    保留时间不重现有两种不同的情况：即保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。保留时间漂移的几种最常见的原因如下：
    一 色谱柱平衡
    如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。
    流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。
    二 固定相稳定性
    固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的PH范围内使用，固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。
    经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。
    三 色谱柱污染
    保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。
    样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取（SPE）等样品前处理方法来去除样品基质的影响。
    避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。
    使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。
    四 流动相组成
    流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。
    五 疏水坍塌
    当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。由是色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱（如Waters SymmetryShield RP色谱柱）或非端基封口的色谱柱（如Waters Resolve色谱柱）也可避免发生坍塌。

液相色谱柱安装与使用说明
    液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
    一、液相色谱柱的安装：
    1、液相色谱柱的结构：
    a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
    柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。
    在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
    b、柱填料：
    液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。
    正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 µm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
    反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
    常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 µm之间。
    2，色谱柱的安装：
    a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
    b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
    c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1／4-1／2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。
    二、液相色谱柱的使用：
    色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
    1、样品的前处理：
    a、最好使用流动相溶解样品。
    b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
    、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
    2、流动相的配制：
    液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
    a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
    b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
    c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
    d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
    e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
    f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
    3、流动相流速的选择：
    因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
    当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

高效液相色谱仪的几个使用问题
    1. 色谱柱中的流动相会排干吗？
    不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
   

2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？
    如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。
    使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。
    使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。
   

3. 如何预防液相泵的故障:
    要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:
    1).用高质量试剂和HPLC级溶剂；
    2）、过滤流动相和溶剂；
    3）、脱气；
    4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；
    5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；
    6）、定期更换垫圈；
    7）、需要时加润滑油；
    8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。
    处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。
    为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。

不错！谢谢了！

很好1谢了！