主题：【讨论】三聚氰胺检测结果

三聚氰胺分析方法包组件清单
包括：
1 Venusil ASB-C18或ASB-C8色谱柱（4.6*250mm,5μm,150Å）1支 ￥3200
2混合型的阳离子交换柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)50支 ￥1150
3三聚氰胺标准品1瓶（500mg，≥99.5%） ￥120
4三聚氰胺分析方法手册1份 赠送
5庚烷磺酸钠（25g/瓶） ￥800
理化性质
三聚氰胺：英文名“melamine”，简称三胺， 学名三氨三嗪， 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分 子 式：C3N6H6、 C3N3(NH2)3 ；分 子 量：126.12 物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m³ ；熔点：在常压下，354℃分解；升华温度：300℃；溶 解 性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性
化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。
固相萃取(SPE)方法
1 固相萃取(SPE)柱的选择：
三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/
二乙烯苯（PEP）吸附剂上，具有阳离子和反相两种吸附机理，并具有以下优点：
1) 可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。
2) 批次重复性好。
3) 回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。
图1 PCX结构式
2 样品前处理步骤：
2.1标准样品配制：
取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提取液(1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。
2.2提取：
称取饲料/奶粉样品5g (或牛奶10ml)，加入50ml 1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL 2%乙酸铅溶液，超声20min。然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3mL过混合型阳离子交换小柱(PCX)。
2.3净化(PCX小柱，60mg/3mL) ：
1) 活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
2) 上样：加入提取液3mL
3) 淋洗：3mL水；3mL 甲醇；弃去淋洗液并将小柱抽干。
4) 洗脱：5mL 5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。
5) 浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL。
2.4检测：
用HPLC-UV中国农业部颁标准检测方法分析，测得PCX柱的回收率结果如下：
添加水平（mg/L）
回收率
空白
0.01
116%
0.1
108%
0.5
92%
2
96%
由上表可以看出：用PCX柱净化样品，可以得到满意的回收率。
HPLC-UV检测方法
三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部颁部的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela) Venusil ASB系列亲水色谱柱，均能得到良好的结果，分析色谱图如下：
1、 三聚氰胺的FDA检测方法
色谱柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm
缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0。
流动相：缓冲液：乙腈=85：15
进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10uL
流 速：1.0mL/min
柱 温：40 oC
波 长：240nm mi 3
2、三聚氰胺的中国农业部颁标准检测方法
色谱柱：Venusil ASB-C18 4.6×250mm
缓冲液：10mM柠檬酸, 10mM庚烷磺酸钠
流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15
进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10uL
流 速：1.0mL/min
柱 温：40℃
波 长：240nm m02468101214mAU0255075100125150175 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100 (AGELA\07052312.D) 8.545 3.528 3.100 5.696
LC-MS参考方法
由于HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，限制了液质联用方法的使用；但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，没有良好的保留与分离。
源于此问题，艾杰尔科技公司自主开发了新的方法，采用艾杰尔(Agela) Venusil ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离，参考方法如下：
缓冲液：10mM NH4AC
流动相：缓冲液：ACN=95：5
流 速：1.0mL/min
进样量：先用70%ACN溶解成约1mg/mL，用ACN稀释成0.1mg/mL，进10uL
柱 温：40℃
波 长：240nm 4
mi01234567mAU050100150200250 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100 (AGELA\07052506.D) 3.839 4.574 3.613
ASB-C8 4.6×250mm (Rt=3.839min;TF(5%)=1.00 ASB-C18 4.6×250mm (Rt=3.651min;TF(5%)=1.05)

用GC/MS 和含水正相LC/MS/MS 分析宠物食品中三聚氰胺和氰尿酸的总解决方案
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Abstract: 用Agilent 7890A-5975C GC/MS 和1200SL-6410 三重串联四极杆液质联用系统，分析宠物食品及相关原料中的三聚氰胺和氰尿酸。GC/MS 方法采用了萃取和三甲基硅烷衍生化法，将该方法用于筛查。检测限为10 μg/g。LC/MS/MS 方法只需要提取，然后用含5 mM 醋酸铵的水和乙腈为流动相，在正相硅胶柱(Rx-Sil) 上进行简单的等梯度洗脱。分离两个化合物仅用5 分钟。三聚氰胺的线性范围从50 pg/mL 到50 ng/mL，氰尿酸从1 ng/mL 到100 ng/mL。用LC/MS/MS 方法分析了复杂食品基质中的目标化合物。

Keywords: 宠物食品毒性, HILIC, 面筋粉 Agilent SIM/Scan, 安捷伦三重串联四极杆,_
Publication Number: 5989-7546CHCN

Updated FCC Developmental Melamine Quantitation (HPLC-UV)
April 2, 2007



Sample Preparation/Extraction:
Wheat gluten: Ground in a Retsch ZM 100 centrifugal rotor mill (ring sieve 0.5 mm).
Moist pet food: Moist chunks and gravy were blended to the consistency of a gritty pudding prior to sampling.

Samples weighed into glass scintillation vials. Extract using 50:50 acetonitrile:water.

Procedure: Add indicated volume of extraction solvent (see note below) 1. Cap and vortex thoroughly, get aggressive with this step (critical due to slow dissolution rate of melamine). Sonicate 30 minutes. Filter portion of extract through 2-stage GMF-nylon (0.45 m m) filters. Dilute filtered extract 250  ml extract + 750  ml solvent 2 to maintain solubility of matrix components.

1 Wheat gluten: Extract in proportion 0.1 g to 10 ml. For melamine contents above 2% w/w, extract in proportion 0.05 g to 15 ml.

1 Moist pet food: Extract in proportion 2.0 – 2.5 g to 10 ml.

2 Solvent for final dilution may be water or 0.1 N HCl. Final dilution is necessary for compatibility with ion-pairing chromatography. We have observed some differences in behavior between the wheat gluten and pet food samples with respect to maintaining solubility during final dilution (these are most likely matrix components which fall out). 0.1 N HCl seems to help maintain solubility for final dilution of the wheat glutens.

HPLC-UV Operating Parameters:
Column: Zorbax Rx C8 (retention is too high on C18 column)
Buffer: 10 mM citric acid, 10 mM sodium octane sulfonate, adjusted to pH 3.0
Mobile phase: 85:15 buffer:acetonitrile
Flow rate: 1.0 ml/min.
Injection volume: 10 ml
Column thermostat: 40 oC (column thermostatting is necessary for ion-pair separations)
Detection wavelength: 240 nm
Spectral collection: 200 – 400 nm (look for lmax near 236 nm)
Retention time: 4.2 - 4.3 min.
Run time: 10 min.

Standard Preparation:
Stock standard was prepared in 76:24 acetonitrile: water. A check stock standard was prepared in 60:40 acetonitrile: water. Dilutions were made in either water or 0.1N HCl giving equivalent calibration curves.

Figures of Merit:
Linear range: established from 1.0 – 400 mg/ml; calibration range 1.0 – 200 mg/ml used for most of work
Reproducibility: duplicate preparations agree within 0.1 - 5% relative basis
Spike/recovery (based on spiking solid melamine powder into test matrix prior to extraction): 90 -110%.

原文由 watericecat 发表:
缺少衍生化试剂，看单位其它科室有没有先。

我这两天正在做，用的也是气质方法，衍生试剂BSTFA:TMCS=99：1，这是可以买到的，国内有公司销售。

非常感谢pingguwu老师提供的方法，不知老师使用的C18 是普通的还是特殊填料的C18？

感謝共享﹐我們也想研究一下。我們在生產海綿是會添加三聚氰胺來提高海綿的防火性。三聚氰胺﹐我手上有很多。

我用小柱净化，结果回收率狂低，我都不明白是怎么搞的，看了看你给的方法，一模一样的，怎么就做不出来呢？？