主题：【分享】蛋白质分离纯化鉴定

理论和操作指南兼有，这样的资料不错，容易上手

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常用液相色谱纯化方法
1、凝胶过滤（gel filtration，molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱，gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱）。
    根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。
    凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
    要点: 采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。

2、离子交换色谱（ion exchange chromatography）
    蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱
    对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。
    两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。

3、疏水作用色谱
    利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。

疏水作用色谱


4、亲和色谱
    利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋白-凝集素，抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱，用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
    亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。
5、反相色谱
    常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素（angiotensin）的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
    同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选择性。

应用举例
例一、一种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab片断（E.coli中表达）
分子量：50 kD
等电点：11
表达定位：周质（periplasmic）
纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离子交换去除大部分杂质，疏水作用色谱进一步去除杂质，最后用凝胶过滤分离。

例二、重组表达的α-淀粉酶
分子量：49.2 kD；等电点：~6
先采用阴离子交换，再进行疏水作用色谱，最后进行凝胶过滤。

例三、重组表达的乙型肝炎表面抗原的分离
1、史克公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，表面活性剂抽提，离心沉淀、超滤，再经凝胶过滤、阴离子交换，超速离心纯化，脱盐，除菌过滤，吸附，分装。
2、Merck公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，去碎片，抗原用多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，甲醛处理，明矾吸附，疫苗。
3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）
培养上清液，离心去碎片，50%硫酸铵沉淀，离心，50%KBr处理，脱盐、超滤浓缩、Sepharose CL-4B凝胶柱分离。
4、Below，M. Bioseparation. 1(1991). 397工艺
破细胞，去碎片，加硫酸铵至一定浓度后，直接上Butyl-Sepharose 4 FF疏水柱，脱盐后上DEAE-Sepharose FF，超滤浓缩后上Sepharose 4 FF凝胶过滤柱。

例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离
（注射用降纤酶）
分子量：38 kD；等电点：~5.4
原工艺：阴离子交换，凝胶过滤，第二次阴离子交换，凝胶过滤
达到95%以上纯度，产量6000-10000单位/克蛇毒。(两周)
新工艺：亲和色谱，阴离子交换，凝胶过滤，亲和色谱（一周）
纯度达到98.5%以上，产量达20000-25000单位/克蛇毒。
尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后，获得了单成分降纤酶组分，电泳为一条带，HPLC为单峰。
如上图所示，由于每一个步骤均会带来一定的损失，故在可能的情况下应尽量减少下游纯化的步骤（在保证达到所需纯度的前提下）。

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