主题:【谱图】图谱来找茬【第二季】

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大家图谱来找茬(第二季)

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要求:1.找出图谱中存在的问题(越多越好噢!)
2.图谱中一个主要问题是基线漂移(在图谱两端基线很平,中间峰却漂移的很大,最小漂移为50左右,最大的有150).
针对峰的漂移你有什么好的建议嘛?
3.如果要对图中的两个峰(图谱中峰1、峰2)进行含量测定,你觉得应该怎样改善条件才可以更好的进行定量分析
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目的:研究某一个厂家注射液的指纹图谱。
色谱条件为:Eclipse XDB-C18(ODS-2,250×4.6 mm,5 μm),甲醇-5%乙酸梯度洗脱,温度:25℃,检测波长:284nm;流速1.0ml/min.进样量:10ul.
检测样品:某厂复方注射剂.
梯度表如下:

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图谱如下:
推荐答案:风之彩回复于2008/10/21
要求:1.找出图谱中存在的问题(越多越好噢!)
2.图谱中一个主要问题是基线漂移(在图谱两端基线很平,中间峰却漂移的很大,最小漂移为50左右,最大的有150).
针对峰的漂移你有什么好的建议嘛?
3.如果要对图中的两个峰(图谱中峰1、峰2)进行含量测定,你觉得应该怎样改善条件才可以更好的进行定量分析
.


1. 走梯度基线漂移是会有的,而且从你的图谱中看漂移也不是很明显,如果想改善,甲醇可以换成乙腈试试,不过成本会比较高。
2. 样品出峰的时候,最好不要在梯度变化的时候,这样重现性可能不太好,而且基线很可能处在上升或下降的过程,基线是倾斜的。我们一般是在样品出峰前几分钟前就将流动相稳定在某一比例,等出完峰再改。
3.柱温可以适当提高,在没有样品出峰的时候,有机相比例可以适当调高一些。
4.走梯度,如果只是要定量,不是要求指纹图谱的话,起始比例可以采用第一个所需的峰刚好和周围的峰分开时的流动相比例来定,等到第一个峰出完或者在出峰前改变有机相比例(就算改了有机相比例也不会影响到将要出的峰),比例至多少要根据你要的下面的化合物的性质等决定。原则上有机相改变的跨度要达到一个平衡:即下面峰的出峰时间长短、峰形好坏、梯度返回平衡的时间长短三者能够达到一个较好的平衡点。
5.如果要指纹图谱,而且用其中的一两个峰定量,那么走梯度还要尽量使每个峰分开。某些液相的工作站可以设定不同形式的梯度曲线(凹形和凸形),而不是直线形式改变梯度,使用的原则就是要使峰密集的地方流动相改变缓慢些,峰稀疏的地方流动相改变快些。
6.走中药一定要注意,因为中药中成分复杂,如果连续进样,为了防止有鬼峰出现,你最后的有机相比例最好设定高一些,并且走上一段时间,再回低有机相平衡。走完第一针,最好走一针空白溶剂,看看会不会有峰干扰你下面的进样。

下面再来看看你的梯度:
1.如果你不要指纹图谱,那么起始有机相的比例完全可以提高一些,只要能确保峰1和周围的峰分开就行。
2.峰1走完后可以迅速切换到峰2所需的比例,但是从图上看峰2似乎包裹了一个小峰,这时的有机相比例应该在摸索一下,最好能分开,流速也可以适当降低些。峰2出完后可以再迅速切换到下一个高些的有机相比例走上一段时间,让后面的峰尽快出尽。
3.最后你的梯度要回到起始比例,且平衡一段时间,我一般看柱压,柱压差不多和进样前一样就可以了。
补充答案:

tanghongmin回复于2008/10/29




首先要说的是你的这张图谱做的真的不敢恭维!好的指纹图谱是几乎每个峰都能基线分离的,大部分能定量,也叫定量指纹图谱。

看你的谱图你使用的仪器应该是岛津或者Agilent,岛津的可能性要大些,关键的问题以下有几个:
1、你的样品前处理有问题,溶剂噪音很大,最好改用流动相最初始比例的溶剂溶解,这样会消除2 min的溶剂峰
2、看你的色谱图和流动相,你使用的高效液相色谱仪检测器不适合这个样品指纹图谱分析,中药复杂成分的指纹图谱最好使用Waters的2996DAD检测器,含1024光电倍增管,而你使用的Agilent或是岛津的DAD对复杂成分紫外可见响应值有问题(我自己多次遇到这样的问题,最后对比上述三家公司仪器得出的结论),建议最好使用Watersd的2996DAD检测器。这样建议的;理由是该检测器在Empower工作站里很方便查看各色谱峰的紫外吸收,从而为指纹图谱的波长选择留下很大余地,换可以选择二维指纹图谱。
3、该色谱柱不适合该样品的指纹图谱,试试Agilent或luna的柱子
4、如楼上各家所见,有机流动相建议使用乙腈,背景噪音会小很多
5、流动相条件太复杂,考虑到重复性等,差不多2-4步梯度变化就可以了

注意了以上的这些后,再对各色谱峰进行流动相的梯度优化,然后就要靠经验了,需要的话可以联系我QQ332806956  niaimin215@163.com

jennysing回复于2008/10/20

1、分析周期较长,峰型欠佳,杂质峰较多
2、可能为初始比例平衡时间不够,建议梯度程序增加回到原比例的步骤。
也可能是杂质的影响,建议改进前处理方法。根据检测波长,排除流动相梯度变化造成的基线波动。
3、可加入三乙胺改善峰型。40min后增加甲醇比例缩短分析时间

海涵回复于2008/10/20

1.初始流动相的有机相可以稍微增大一点点
2.40~60min之间的流动相变化太慢,可以在40~50min将有机相的比例调节到稍微比40%大一点点。
3.50~60min之间可以将流动相调回到初始比例,这样进下一针不至于因为流动相的变化太大而导致仪器难平衡。最好是在梯度里加入一个后运行时间,就是用初始的流动相比例平衡几分钟效果会更佳
4.可以稍微升高一点柱温30~40度的柱子温度可能较合适!

ygx回复于2008/10/21

1.分析运行时间较长:提高5~10,40~60分钟时间段的甲醇比例,当然也可以适当提高柱温。
2.基线的漂移,似乎在梯度中都存在,不易消除,但是可以利用工作站或仪器的背景扣除功能来改善图谱情况。
3.你是不是象前面几位所讲,可以在梯度结束时加一个恢复初始值设置,以便仪器稳定。
4.从图谱看,完全可以对峰1、2进行定量。不过,图谱中杂质峰较多,可以采用外标法或标准曲线法进行定量。

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5-15min梯度可以加快一点,似乎没有必要需要10min

40-60min时间太长,同样可以缩短
海涵
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1.初始流动相的有机相可以稍微增大一点点
2.40~60min之间的流动相变化太慢,可以在40~50min将有机相的比例调节到稍微比40%大一点点。
3.50~60min之间可以将流动相调回到初始比例,这样进下一针不至于因为流动相的变化太大而导致仪器难平衡。最好是在梯度里加入一个后运行时间,就是用初始的流动相比例平衡几分钟效果会更佳
4.可以稍微升高一点柱温30~40度的柱子温度可能较合适!
jennysing
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1、分析周期较长,峰型欠佳,杂质峰较多
2、可能为初始比例平衡时间不够,建议梯度程序增加回到原比例的步骤。
也可能是杂质的影响,建议改进前处理方法。根据检测波长,排除流动相梯度变化造成的基线波动。
3、可加入三乙胺改善峰型。40min后增加甲醇比例缩短分析时间
迷失的精灵
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一、申报资料内容和数据雷同,申报资料存在一图多用、数据造假等问题  1.不同品种的研究资料、数据相同或雷同  该项雷同是指同一单位不同品种,或不同单位同一品种/不同品种之间的研究资料的文字、实验数据、照片/图谱相同或有较明确证据的雷同,包括:研究资料中主要试验数据一致,TLC照片特征明显、可以确认相同,研究图谱雷同(如HPLC图谱峰形相似可以重叠并有多数峰或全部峰保留时间相同)等。
  2.不同申请人申请原料药的合成工艺路线相同,且经试验摸索确定的工艺条件相同(只是投料量按比例放大/缩小的);不同申请人申请制剂的处方工艺类同,且经试验摸索确定的关键工艺参数完全相同。
  3.同一品种HPLC/GC图谱各峰的保留时间、记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。>基线构成之面积称峰面积>峰面积(和/或峰高)完全一致,或多个峰中仅个别峰有微小差别,或TLC照片完全一致,存在一图多用的问题(包括:同一时间点不同批号样品、不同时间点相同批号或不同批号样品等)。  该项问题是指同一品种存在较明确的一图多用(包括认为修改图谱和/或数据)的证据。对于TLC照片,主要通过斑点的形状、Rf值、原点和溶剂前沿特征、薄板边角特征和薄板斑点外其他区域显色情况等综合判定是否一致。对于HPLC/GC图谱,主要从保留时间、峰面积(和/或峰高)判定,其中保留时间相同,多个峰(半数以上)峰面积和/或峰高一致的情况在实际工作中不可能出现,可以判定系人为修改获得。
  4.HPLC/GC图谱的峰形相似,各峰的保留时间完全一致或多数峰的保留时间完全一致,峰面积(峰高)不同或仅有少数峰的峰面积(峰高)相同(包括:同一时间点不同批号样品、不同时间点相同批号或不同批号样品等)。  该种现象在实际工作中也几乎不可能出现,可依据图谱及色谱峰的数量、保留时间相同峰的比例等进行判定。对于同时存在少数峰的峰面积和/或峰高,半峰宽、塔板数等一致的,是更充分的证据;对于试验日期相隔数日或数月仍出现上述问题的,也是较充分的证据。  判断时还应注意:对于HPLC图谱中容量因子小于3的色谱峰,出现个别色谱峰保留时间一致的概率可能较高;对于GC图谱,色谱峰保留时间一致的概率可能较HPLC图谱高;保留时间的有效位数和保留时间出现一致的概率有关,较少的有效位数出现保留时间一致的概率大。
5.HPLC/GC图谱的峰形相似,各峰的峰面积(和/或峰高、峰宽)完全一致或多数峰的峰面积(和/或峰高、峰宽)一致,但各峰的保留时间不同(包括:同一时间点不同批号样品、不同时间点相同批号或不同批号样品等)。  该项问题主要依据色谱峰峰面积是否一致进行判定。此处“多数峰”可根据半数以上色谱峰峰面积一致判定。
  6.HPLC图谱中仅显示一个峰,但多张图谱保留时间(和峰面积)完全一致(包括:同一时间点不同批号样品、不同时间点相同批号或不同批号样品等)。  该项问题主要依据多张图谱的单峰的保留时间(和峰面积)是否一致进行判定。对于研究资料中存在大量图谱的单峰的保留时间(和峰面积)一致,尤其是试验跨度较大、试验相隔较长时出现上述问题,均是较充分的证据。
  7.HPLC色谱图采集时间与运行时间矛盾。  该项问题主要依据连续试验得到的图谱中的采集时间先于研究资料中方法规定的时间和图谱显示的试验时间进行判定,还包括连续多张HPLC图谱中运行时间与采样时间衔接正好吻合的问题。
  8.HPLC色谱图保留时间与坐标轴标示矛盾,或数据表与图中保留时间不一致。
  9.不同申报单位或同一申报单位不同批号样品的IR、粉末X线衍射、UV、核磁共振等图谱及相关数据(UV指波长和吸收度)完全一致。
  10.HPLC色谱图中各峰保留时间的绝对差值相同或呈规律性变化,不符合色谱行为的基本规律(包括:同一时间点不同批号样品、不同时间点相同批号或不同批号样品等)。  该项问题主要依据图谱之间各峰保留时间的绝对差值规律性变化进行判定,比对中需注意图谱之间的相似性和图谱中色谱峰数量,如色谱峰过少可能会影响判定。
  11.效价测定中,抑菌圈数据相同;或微生物方法学研究中,试验组的数据相同(包括:不同时间点、不同批号等)。
  12.特殊安全性试验、生物等效性试验等研究资料中照片、图谱相同或雷同(包括:不同时间点、不同批号等)。  特殊安全性试验数据、照片相同包括以下六种情况:不同单位同一品种、不同单位不同品种、同一单位不同品种、同一单位同一品种不同动物编号、同一单位同一品种同一动物不同部位的安全性试验的试验数据、照片相同;生物等效性试验主要依据研究数据、色谱图/光谱图雷同进行判定。
  13.不同单位注射剂过敏性试验结果相同(指不同单位的同一品种和同一单位的不同品种动物编号及相对应的试验数据完全一致)。
  14.其他申报资料图谱、数据造假现象(指申报资料图谱、数据存在不合常理之处)。  主要现象包括:  (1)多张或多组HPLC/GC图谱的进样时间(小时、分、秒)完全相同。  (2)不同HPLC/GC图谱之间峰形相似,图中显示的峰高接近,数据表(分析结果表)中多数峰的峰面积、峰高数据相近,但个别峰的峰面积、峰高数据相差数倍以上。  (3)HPLC/GC图谱数据表中各峰的峰面积、峰高加和与数据表中显示的总峰面积、总峰高数据不一致,且相差较大。  (4)图谱信息部分存在明显有背常理的地方。例如,进样时间为“28:18:26”、日期为“2005-3-71”;一张HPLC图谱中数据采集日期为“Jnn 05,2005”,而其它图谱上日期均为Jun。  (5)大量HPLC图谱中所有峰保留时间末位或后2~3位数呈现特征性。例如均为“8”或“5”或“2”;或所有色谱峰保留时间末位数均为0,3或7;或同一张色谱图中多个色谱峰保留时间最后2位数或最后3位数一致。  (6)图谱的打印时间(或报告时间)早于其进样时间(或试验运行时间)。  (7)HPLC方法学研究中破坏性试验在不同破坏试验条件下得到的图谱相似、叠放能够重合,特别是采用低波长检测时,溶剂峰的峰形相似。(上述问题可结合化合物的稳定性、所采用的破坏条件等综合判断)
  二、存在资料/图谱类似、或有研究资料造假嫌疑,可作为进一步查证的线索
1.HPLC/GC图谱叠放能够重合,各峰的峰面积不一致,少数峰保留时间相同;TLC照片类似(包括:同一时间点不同批号样品、不同时间点相同批号或不同批号样品等)。
  2.HPLC色谱图的保留时间完全一致或多数峰的保留时间一致,但峰形不同。
  3.合成工艺、处方及工艺研究、质量研究、稳定性试验等资料文字、撰写思路和模式雷同,但研究数据不同。
  4.相同保留时间的色谱峰在数据表中重复出现,但峰高和峰面积不同,对于容量因子小于3的色谱峰,出现上述问题的概率增加,需注意。
  5..同一品种不同用途图谱(不同试验可以合理共用图谱除外)的文件名、图谱和数据完全相同(如仅发现一对可继续查证)。
  6.色谱图数据表中个别峰保留时间位数与多数峰不一致等。

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图谱中峰的漂移建议

  解决因色谱峰保留时间漂移造成的谱图间谱峰匹配的困难,是该技术推广应用过程中的一个重要课题。 梁逸曾等[2,3]提出用光谱相关色谱进行色谱峰匹配,利用DAD数据实现了色谱峰的分辨和对应匹配,该法充分利用了光谱与色谱的信息去实现根据紫外光谱可以分辨的各个物质峰的匹配,无疑可提供比根据定波长色谱积分数据进行匹配更为准确和可靠的色谱匹配结果。

  中药、天然产物中成分众多,结构复杂,即使利用DAD数据也难以一一确定其结构与含量,所以希望采用指纹图谱从整体上把握其本质和特征。因此,指纹图谱具有“整体性” 和“模糊性”两个基本属性[4]。从这个意义上讲,对结构非常接近、难以分辨的峰进行积分归并是符合指纹图谱技术提出的出发点及目前生产实践中常用定波长下色谱图的实际状况的。鉴于此,本研究只讨论此类色谱图的匹配问题。

  陈闽军等[5]用遗传算法进行色谱图匹配,需要在色谱图中分区间定义局部特征,有可能导致区间邻接位置的同一色谱峰被划分入不同的区间。国家药检委员会推出的以该算法为基础的应用软件自动匹配结果有时与观察特征不一致,须通过手动校正进行调整。文献[6]以单波长或多波长原始色谱数据为基础,提出了通过动态规划进行色谱图匹配的相关优化伸缩(COW) 匹配方法。该法虽然不需要对谱图进行峰识别和积分,但也存在与文献[5]类似的不足及其它问题(详见本文3.5节)。本研究以色谱积分结果为基础,提出基于图论理论的全局最优匹配色谱图的方法,希望能克服文献[5,6]方法的缺陷。

  2  方法原理

  2.1  匹配的图论原理

  分别用(t1,i,A1,i, i=1,2,…,p)与(t2,j,A2,j, j=1,2,…,q)表示标准谱与待匹配色谱图的峰保留时间和峰面积,将标准色谱指纹图谱的峰面积、保留时间信息列于图1的第一行,被考评的色谱指纹图谱的矩阵元素列于图1的第一列。如果这两张图谱的出峰时间、峰的个数完全一致,则两张色谱图中相匹配的峰必定在图1的对角线上。由于实际中两张色谱图中的出峰时间、峰个数不太可能完全一致,需要根据实际情况对对应峰的保留时间进行校准,使其与标准图谱的峰相匹配,这个调整应在一定范围内进行。实际应用中,保留时间相差太大或峰形相差太大的峰可以排除在允许匹配范围之外,表示在图1中就是与标准图谱相匹配的峰应在对角线附近(即为图1中阴影单元)。

  2.2  匹配域参数的定义

  2.2.1  保留时间参数(τm和tm) 

  记ts为标准谱图对应峰保留时间,tm为允许的最小保留时间差,τm为允许的最小相对保留时间差。待匹配图谱和标准图谱进行比较时,其对应峰的保留时间差Δt应满足:|Δt|<tsτm+tm(1)在两张色谱图中,保留时间越大,其对应峰保留时间差的绝对值可能越大。采用上述两参数约束可兼顾色谱图中不同区间保留时间漂移程度不同的特点。

  2.2.2  峰面积参数am和Am

  Am可取最小峰面积值或其数倍值。am指待匹配谱图的峰与标准图谱对应峰的允许最大面积差与标准峰面积之比,实际应用时可以定义一个足够大的初始值(如允许峰面积相差10倍,则可定义am为10)。以A表示待匹配色谱图的峰面积,As为标准谱图对应峰面积,允许匹配的峰面积采用下式约束:    分 析 化 学第34卷第10期倪力军等:基于图论的色谱指纹图谱谱峰的全局匹配    As/(1+am)-Am<A<As(1+am)+Am(2)    采用式(2)的约束方式可兼顾峰面积大小不同的峰,有效拓宽限制域。

  采用τm、tm与am,Am 4个参数,通过式(1)与式(2)的约束,可将允许匹配的区域限制在图1的对角线附近。对图1所示的两张色谱图所有的峰进行遍历匹配的次数是2pq,匹配算法的复杂程度随着色谱峰数量的增加而剧增。在实际匹配时,通过约束条件可排除不合理的匹配,降低问题复杂性,简化寻找最佳匹配峰的过程。

  2.3  基于图论的色谱峰优化匹配

  为算法便利,在色谱图前、后端足够远处各标记一个面积为0的参考允许匹配峰,作为允许匹配区域的起点和终点。选取两个匹配峰组的保留时间与峰面积加权总和作为两个匹配对点之间的有向距离,则问题转化为寻找从起始点匹配对到终止点匹配对的最短路径,即为最优匹配。

  以允许匹配域中包括两个参考匹配峰在内的m个匹配峰组(i1,j1)、(i2,j2)、(i3,j3)……(im,jm)作为有向图中的m个点,式中i、j分别为对应的参考色谱图和待匹配色谱图的色谱峰的序号,对于任意k1,k2∈{1,2,…,m},定义距离矩阵D,其中D(k1,k2)为k1点到k2距离:D(k1,k2)=    0,      k1=k2  wA(ik2    n=ik1As,n+jk2    n=jk1An+|As,ik2-Ajk2|)=wt|ts,ik2-tjk2|  (ts,ik2+tm)      ik1<ik2 and jk1<jk2    ∞,ik1>ik2 or jk1>jk2(3)式中wA,wt分别为在最优匹配中所考察的峰面积差异因素和保留时间差异因素的权重,在实际应用时由用户设定(具体取值和影响将在后面讨论);根据文献[7,8]提出的最短路径的算法,在MATLAB6.5实现了色谱图的全局最优匹配。

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图谱中峰的漂移建议

  首先引进一个辅助向量E,其每个分量E(i)表示当前点的集合V中所找到的从起始点v1到每个终止点vi的最短路径的长度。初态为:E(i)=min{E(i)|vi∈V}。具体算法如下:
  ()对于表示含有m个点的有向图的距离矩阵D,S为已找到从v1出发的最短路径的终点的集合,S的初始值为空集,E(i)的初始值为:E(i)=D(1,i)  vi∈V。

  ()选择vj,使得E(i)=min{E(i)|vi∈VS}, vj就是当前求得的一条从v1出发的最短路径的终点。令S=S∪{j}。

  ()修改从v1出发到集合VS上任一顶点vk的最短路径长度。如果E(i)+D(j,k)<E(k),则使  E(k)=D(j,k)+E(j)。

  ()重复步骤()和()共m-1次,即可求得从起始点v1到图上其余各顶点的最短路径。

  3  结果与讨论

  通过如下两例对本研究提出的色谱指纹图谱匹配算法进行验证。

  算例1:对同一厂家、不同时间生产的40批珍菊降压片的HPLC色谱指纹图谱进行匹配(色谱数据由上海中药研究所提供),考察各匹配参数对匹配结果的影响,确定匹配参数的适宜值。

  算例2:对本实验室在工业模式中药自控制备平台上所得的不同批次的丹参提取物(3批)、柴胡提取物(5批)在HP公司的Aglient 1100 HPLC上测定图谱(色谱条件略),根据优化的匹配参数,分别采用本研究提出的算法和色谱指纹图谱分析软件对同一药材提取物的色谱图、20组随机抽取的珍菊降压片HPLC谱图进行匹配并比较匹配结果。对匹配结果进行检验,统计谱图所匹配的峰组总数N、根据谱图直观特征判定的明显匹配错误的峰组总数n,以及应匹配而程序未能将其匹配的峰组总数L。 

  3.1  峰面积参数对匹配结果的影响

  固定保留时间参数与权重比在一个较大的范围内,即tm=0.5,τm=0.05,wt/wA=100,调整峰面积参数Am和am,根据匹配结果确定本算法中的最优峰面积参数。从40张珍菊降压片谱图中随机抽取10对图谱进行匹配。10组图谱匹配的统计结果见表1。

  从表1可知,无论am处在何种水平,匹配峰的个数随Am逐渐增加。应匹配而未匹配的峰组数目与Am,am的设置密切相关:当二者中有0值出现且均取得偏小时易造成应匹配的峰未被匹配,尤其是am=0时,匹配峰的约束条件退化为As-Am<A<As+Am,遗漏峰非常多。当am2且Am10时,可使L为0。当Am=30,am=3时,匹配峰组总数达到极大值,再增大Am与am,各项匹配统计数据不再改变。

  3.2  保留时间参数对匹配结果的影响考察

  将峰面积参数与权重比例固定在一个较大的范围内,即Am=30,am=3,wt/wA=100, 改变tm和τm的值,随机抽取10对珍菊降压片谱图进行匹配,结果见表2。表1  不同峰面积参数下珍菊降压片HPLC谱图匹配结果(略)表2  不同保留时间参数下珍菊降压片HPLC谱图匹配结果(略)

  表2具有与表1相类似的规律:无论τm处在何种水平,匹配峰组总数随着保留时间参数 tm的增长而加大,且漏配峰组数目L不断下降。当tm=0.5,τm=0.05时,匹配峰组总数N达到最大,不再随τm、tm的增长而发生变化,且L与错误率保持为0。当τm或tm为0时,易造成应匹配而未被匹配的峰组出现。

  3.3  权重比值对匹配结果的影响

  把峰面积参数与保留时间参数固定在一个较大的范围内,即tm=0.5,τm=0.05,Am=30,am=3,进行权重比例的调整。对随机抽取的10组珍菊降压片HPLC谱图进行匹配,发现权重比例的值对最后的结果影响不大,可以将其设置为任一大于1的数值。最终确定以下优化的匹配参数作为色谱图匹配算法中的默认值:tm=0.5,τm=0.05;Am=30,am=3,wt/wA=10。

  3.4  两种方法对中药色谱指纹图谱匹配结果的比较

  采用本研究提出的算法(有关匹配参数采用上面建议的默认值)与中药指纹图谱软件的自动匹配方法分别对40批珍菊降压片谱图(随机抽取20组)、5批柴胡提取物谱图(随机抽取5组)、3批丹参提取物谱图(随机抽取3组)、15批人参提取物A、17批人参提取物B、C色谱图(均随机抽取10组)进行色谱峰的匹配,有关结果列于表3。表3  2种方法对各中药色谱指纹图谱匹配的结果对比(略)

  从表3可知本算法所匹配的峰组总数均高于或等于软件算法的结果。除人参提取物A的色谱图匹配时,本算法有一个不明显的漏配峰组外,其余谱图均无漏配峰组。而软件给出的结果中,除柴胡皂苷提取物的色谱图无漏配峰组外,其余谱图均有数目不等的漏配峰组(数目在9~87之间)且有部分图谱出现明显与直观特征不符的错配峰组。

  3.5  特殊情况下有关参数的设置

  上面讨论的色谱图均是在同一台液相色谱仪、同一根色谱柱下所取得的,一般保留时间不会有太大漂移。但在实际应用中,由于色谱数据可能来自不同测试单位,虽然色谱条件相同但所用色谱柱可能不同,会造成同一物质保留时间的巨大差异。为此,实验取某珍菊降压片HPLC谱图(见图2最上面的谱图),对其保留时间作一非线形转换,构造了两个最大保留差在10 min以上的图谱(见图2下面两张图谱)。显然,取默认参数tm=0.5,τm=0.05时图2中的图谱无法满足式(1)的匹配约束。根据图2的图谱特征,取 tm=3,τm=0.4,可使20~50 min内的各谱峰的保留时间波动范围大于10 min,最终对图2中的3张图谱100%匹配正确(见图3)。

  由此可见,在图谱特征有比较明显的对应关系的情况下,本方法可根据直观图谱特征合理设置匹配参数,克服了保留时间的漂移,对图谱进行正确匹配。而文献[6]中的方法对于伸缩参数t的设置虽然提出了一个不宜过大或过小的原则,但未提出具体的t值选择方法和范围,在具体应用时,不易把握合适的t值。对于图2所示的情况很容易出现匹配错误。

  总之,本研究提出的基于图论原理的色谱指纹图谱谱峰匹配方法具有较大的灵活性,在保留时间漂移小于3.5 min(60 min内)的情况下,可以取本方法提供的默认参数进行色谱峰的匹配。当保留时间漂移大于3.5 min时,可参照谱图特征设置适当的tm与τm使(1)式得以满足,即可获得良好匹配结果。但对于因色谱柱厂家不同而造成同类样品色谱分离度有明显不同的情况,仅仅依靠色谱信息无法实现正确匹配,本文及文献[5,6]的算法并不适用,需要进一步完善和改进。

  致 谢  感谢上海中药研究所中药室张国明先生提供珍菊降压片色谱指纹图谱数据。

  References

  1  Editorial Committee of the Pharmacopoeia of the People′s Republic of China(中华人民共和国药典委员会).Research Guide of Chromatographic Fingerprints Experiment of TCM (Protocol) (中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)). 2002

  2  Li Boyan(李博岩),Liang Yizeng(梁逸曾),Hu Yu(胡  芸). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2004, 32(3): 313~316

  3  Gonga F, Liang Y Z, Fung Y S, Chauc F T. J. Chromatogr. A, 2004, 1029: 173~183

  4  Xie Peishan(谢培山).The Treatises Collection of International Symposium of TCM Quality Assessment by HPLC Fingerprints (国际色谱指纹图评价中药质量研讨会学术报告论文集).Guangzhou(广州), 2001: i3l,i327

  5  Chen Minjun (陈闽军),Chen Yiyu(程翼宇). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2003, 31(5): 513~517

  6  Nielsen P V,  Carstensen J M, Smedsgaard J.  J. Chromatogr. A, 1998, 805: 17~35

  7  Edward Minieka ,Marcel Dekker,translated by Li Jiaying(李家滢),Zhao Guanqi(赵关旗). Optimization Algorithms for Network and Graphs (网络和图的最优化算法). Beijing(北京):China Railway Publishing House (中国铁道出版社), 1984:  36~46

  8  Dijkstra E W. A Note on Two Problems in Connection with Graphs.Numerische Mathematik, 1959, 1: 269~276
tonghuahuaxue
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1.起始流动相中甲醇比例提高一些,如10%。在30分钟处就改甲醇比例为40%,缩短出峰时间。同时,在甲醇最高比例下多走一些时间,以确认峰已出完。
2.作梯度有一个麻烦事,就是为保证下一次进样的重现性需平衡较长的时间。所以做梯度多在研发而少在成品检测(可能是寡闻)
3.图的细节看不清,是基线高还是样品浓度较低,看起来一堆小峰,需不需要改一下波长
ygx
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1.分析运行时间较长:提高5~10,40~60分钟时间段的甲醇比例,当然也可以适当提高柱温。
2.基线的漂移,似乎在梯度中都存在,不易消除,但是可以利用工作站或仪器的背景扣除功能来改善图谱情况。
3.你是不是象前面几位所讲,可以在梯度结束时加一个恢复初始值设置,以便仪器稳定。
4.从图谱看,完全可以对峰1、2进行定量。不过,图谱中杂质峰较多,可以采用外标法或标准曲线法进行定量。
xy200609
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样品运行时间过长,40-60分钟梯度不必要,可在35分钟将甲醇比例尽快升上去,使其它峰尽快洗脱出来。
定量分析峰1和峰2,可以用外标法或内标法(如能找到合适内标物),当然最好扫描一下,尽可能用它们最大吸收波长。
不知图谱中其它峰是溶剂系统峰或是杂质峰,若是溶剂系统峰则还可加大进样量,使分析峰提高(当然必须在线性范围内)以减小分析误差。如果是杂质峰就没必要了。
风之彩
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要求:1.找出图谱中存在的问题(越多越好噢!)
2.图谱中一个主要问题是基线漂移(在图谱两端基线很平,中间峰却漂移的很大,最小漂移为50左右,最大的有150).
针对峰的漂移你有什么好的建议嘛?
3.如果要对图中的两个峰(图谱中峰1、峰2)进行含量测定,你觉得应该怎样改善条件才可以更好的进行定量分析
.


1. 走梯度基线漂移是会有的,而且从你的图谱中看漂移也不是很明显,如果想改善,甲醇可以换成乙腈试试,不过成本会比较高。
2. 样品出峰的时候,最好不要在梯度变化的时候,这样重现性可能不太好,而且基线很可能处在上升或下降的过程,基线是倾斜的。我们一般是在样品出峰前几分钟前就将流动相稳定在某一比例,等出完峰再改。
3.柱温可以适当提高,在没有样品出峰的时候,有机相比例可以适当调高一些。
4.走梯度,如果只是要定量,不是要求指纹图谱的话,起始比例可以采用第一个所需的峰刚好和周围的峰分开时的流动相比例来定,等到第一个峰出完或者在出峰前改变有机相比例(就算改了有机相比例也不会影响到将要出的峰),比例至多少要根据你要的下面的化合物的性质等决定。原则上有机相改变的跨度要达到一个平衡:即下面峰的出峰时间长短、峰形好坏、梯度返回平衡的时间长短三者能够达到一个较好的平衡点。
5.如果要指纹图谱,而且用其中的一两个峰定量,那么走梯度还要尽量使每个峰分开。某些液相的工作站可以设定不同形式的梯度曲线(凹形和凸形),而不是直线形式改变梯度,使用的原则就是要使峰密集的地方流动相改变缓慢些,峰稀疏的地方流动相改变快些。
6.走中药一定要注意,因为中药中成分复杂,如果连续进样,为了防止有鬼峰出现,你最后的有机相比例最好设定高一些,并且走上一段时间,再回低有机相平衡。走完第一针,最好走一针空白溶剂,看看会不会有峰干扰你下面的进样。

下面再来看看你的梯度:
1.如果你不要指纹图谱,那么起始有机相的比例完全可以提高一些,只要能确保峰1和周围的峰分开就行。
2.峰1走完后可以迅速切换到峰2所需的比例,但是从图上看峰2似乎包裹了一个小峰,这时的有机相比例应该在摸索一下,最好能分开,流速也可以适当降低些。峰2出完后可以再迅速切换到下一个高些的有机相比例走上一段时间,让后面的峰尽快出尽。
3.最后你的梯度要回到起始比例,且平衡一段时间,我一般看柱压,柱压差不多和进样前一样就可以了。
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