主题:【资料】显微镜基础知识和原理(一)

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第一章: 显微镜简史
随着科学技术的进步,人们越来越需要观察微观世界,显微镜正是这样的设备,它突破了人类的视觉极限,使之延伸到肉眼无法看清的细微结构。
显微镜是从十五世纪开始发展起来。从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜,到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜,以及相差,荧光,偏光,显微观察方式的出现,使之更广范地应用于金属材料,生物学,化工等领域。

第二章 显微镜的基本光学原理
一. 折射和折射率
光线在均匀的各向同性介质中,两点之间以直线传播,当通过不同密度介质的透明物体时,则发生折射现像,这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时,光线在其介面改变了方向,并和法线构成折射角。
二. 透镜的性能
透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件,物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同,可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。
当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点,这个点称“焦点”,通过交点并垂直光轴的平面,称“焦平面”。焦点有两个,在物方空间的焦点,称“物方焦点”,该处的焦平面,称“物方焦平面”;反之,在像方空间的焦点,称“像方焦点”,该处的焦平面,称“像方焦平面”。
光线通过凹透镜后,成正立虚像,而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来,而虚像不能。
三. 影响成像的关键因素—像差
由于客观条件,任何光学系统都不能生成理论上理想的像,各种像差的存在影响了成像质量。下面分别简要介绍各种像差。
1. 色差(Chromatic aberration)
色差是透镜成像的一个严重缺陷,发生在多色光为光源的情况下,单色光不产生色差。白光由红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 七种组成,各种光的波长不同 ,所以在通过透镜时的折射率也不同,这样物方一个点,在像方则可能形成一个色斑。光学系统最主要的功能就是消色差。
色差一般有位置色差,放大率色差。位置色差使像在任何位置观察都带有色斑或晕环,使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。
2. 球差(Spherical aberration)
球差是轴上点的单色相差,是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是,一个点成像后,不在是个亮点,而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑,从而影响成像质量。
球差的矫正常利用透镜组合来消除,由于凸、凹透镜的球差是相反的,可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜,物镜的球差没有完全矫正,应与相应的补偿目镜配合,才能达到纠正效果。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。
3. 慧差(Coma)
慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时,发出的光束通过透镜后,不再相交一点,则一光点的像便会得到一逗点状,型如慧星,故称“慧差”。
4. 像散(Astigmatism)
像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场很大时,边缘上的物点离光轴远,光束倾斜大,经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线,在理想像平面上综合后,形成一个椭圆形的斑点。像散是通过复杂的透镜组合来消除。
5. 场曲(Curvature of field)
场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时,整个光束的交点不与理想像点重合,虽然在每个特定点都能得到清晰的像点,但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时看清整个像面,给观察和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜,这种物镜已经矫正了场曲。
6. 畸变(Distortion)
前面所说各种像差除场曲外,都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的像差,光束的同心性不受到破坏。因此,不影响像的清晰度,但使像与原物体比,在形状上造成失真。
四. 显微镜的成像(几何成像)原理
显微镜之所以能将被检物体进行放大,是通过透镜来实现的。单透镜成像具有像差,严重影响成像质量。因此显微镜的主要光学部件都由透镜组合而成。从透镜的性能可知,只有凸透镜才能起放大作用,而凹透镜不行。显微镜的物镜与目镜虽都由透镜组合而成,但相当于一个凸透镜。为便于了解显微镜的放大原理,简要说明一下凸透镜的5种成像规律:
(1) 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时,则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像;
(2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时,则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像;
(3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像;
(4) 当物体位于透镜物方焦点上时,则像方不能成像;
(5) 当物体位于透镜物方焦点以内时,则像方也无像的形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚像。
显微镜的成像原理就是利用上述(3)和(5)的规律把物体放大的。当物体处在物镜前F-2F(F为物方焦距)之间,则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜的设计上,将此像落在目镜的一倍焦距F1之内,使物镜所放大的第一次像(中间像),又被目镜再一次放大,最终在目镜的物方(中间像的同侧)、人眼的明视距离(250mm)处形成放大的直立(相对中间像而言)虚像。因此,当我们在镜检时,通过目镜(不另加转换棱镜)看到的像于原物体的像,方向相反。
五.显微镜光学系统简介
显微镜光学系统的设计有三种光学系统。
1 . 长筒光学系统
2 . 万能无限远校正光学系统:是较先进的光路设计,它体现了无限远校正方式的优越性。光线通过物镜后成为平行光束通过镜筒,并在结像透镜处折射或完成无像差的中间像。物镜与观察筒内结像透镜之间可添加光学附件,而不影响总放大倍数。另外这种光学系统不需要安装附加校正透镜,都能得到最佳的显微图像。
3. 万能无限远双重色差校正光学系统:是目前最先进的光路设计,不但能矫正位置色差,同时还能矫正倍率色差可提高水平分辨率12%,提供最高反差、最高衬度、最高分辨率的最锐利图象。


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第三章 显微镜的重要光学技术参数
在镜检时,人们总是希望能得到清晰而明亮的理想图像,这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准,并且要求在使用时,必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样,才能充分发挥显微镜应有的性能,得到满意的镜检效果。
显微镜的光学技术参数包括:数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好,它们之间是相互联系又相互制约的,在使用时,应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系。
一. 数值孔径
数值孔径简写NA(蔡司公司的数值孔径简写CF),数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数,是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低(即消位置色差的能力,蔡司公司的数值孔是代表消位置色差和倍率色差的能力),的重要标志。其数值的大小,分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。
数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(η)和孔径角(u)半数的正玄之乘积。用公式表示如下:NA=ηsinu/2 孔径角又称“镜口角”,是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大,进入物镜的光通亮就越大,它与物镜的有效直径成正比,与焦点的距离成反比。
显微镜观察时,若想增大NA值,孔径角是无法增大的,唯一的办法是增大介质的折射率η值。基于这一原理,就产生了水浸系物镜和油浸物镜,因介质的折射率η值大于一,NA值就能大于一。数值孔径最大值为1.4,这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前,有用折射率高的溴萘作介质,溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。这里必须指出,为了充分发挥物镜数值孔径的作用,在观察时,聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值,数值孔径与其它技术参数有着密切的关系,它几乎决定和影响着其它各项技术参数。它与分辨率成正比,与放大率成正比,与焦深成反比,NA值增大,视场宽度与工作距离都会相应地变小。
二. 分辨率
分辨率又称“鉴别率”,“解像力”。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。显微镜的分辨率用公式表示为:d=0.61λ/NA 式中d为最小分辨距离;λ为光线的波长;NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大,照明光线波长越短,则d值越小,分辨率就越高。
1. 要提高分辨率,即减小d值,可采取以下措施。 降低波长λ值,使用短波长光源。
2.曾大介质η值和提高NA值(NA=ηsinu/2)。
3.消色差。
4.增加明暗反差。
三. 放大率
放大率就是放大倍数,是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后,人眼所看到的最终图像的大小对原物体大小的比值,是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大率也是显微镜的重要参数,但也不能盲目相信放大率越高越好,在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。
四. 焦深
焦深为焦点深度的简称,即在使用显微镜时,当焦点对准某一物体时,不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚,而且在此平面的上下一定厚度内,也能看得清楚,这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层,而焦深小,则只能看到被检物体的一薄层,焦深与其它技术参数有以下关系:
1.焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。
2.焦深大,分辨率降低。
由于低倍物镜的景深较大,所以在低倍物镜照相时造成困难。在显微照相时将详细介绍。
五. 视场直径(Field of view)
观察显微镜时,所看到的明亮的原形范围叫视场,它的大小,是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度,是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径23最为科学,大视场容易引起场曲。 F=FN/Mob F: 视场直径,FN:视场数,Mob:物镜放大率。视场数(Field Number, 简写为FN),标刻在目镜的镜筒外侧。
由公式可看出:
1. 视场直径与视场数成正比。
2. 增大物镜的倍数,则视场直径减小。因此,若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌,而换成高倍物镜,就只能看到被检物体的很小一部份。
六. 覆盖差
显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准,光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变,从而产生了像差,这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成像质量。国际上规定,盖玻片的标准厚度为0.17mm, 许可范围在0.16—0.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的像差计算在内。物镜外壳上标记0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。
七. 工作距离
工作距离也叫物距,即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时,被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此,它与焦距是两个概念,平时习惯所说的调焦,实际上是调节工作距离。在物镜数值孔径一定的情况下,工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜,其工作距离小。
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