6、RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul,反应条件如下:
注:在55度这一步骤中要收集荧光信号(FAM)。
* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检验
1)探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性,则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的,严格的按照步骤规则重新实验。
2)在37个循环处或者37个循环之前,所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线,这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA,也表明了样本质量合格。然而,可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时,从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本,经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性,则说明:
(1)从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染;
(2)没有足够的人类细胞以备检测;
(3)方法建立和实施不当;
(4)试剂和仪器原因。
3)在40个循环之内,HSC组中InfA,swFluA,swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线,那么有以下解释:
(1)可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。
(2)RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
(3)在40个循环之前,PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效,应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因,订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
(4)当所有对照都满足要求后,如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时,则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性,那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应(swInfA和swH1)的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉,则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性,请联系CDC做进一步指导。
(5)在所有对照都满足要求的前提下,如果在40个循环内,待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1)实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训,熟练掌握后方可进行试验。
2)当样本量不足可能会产生假阴性结果,造成的原因可能是不当的收集,运输或处理。
3)如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制,则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释(例如1:10或1:100)来重复试验。