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主题：【求助】在C4和C18都没有保留的蛋白质，求高手帮忙分析下

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yuan_log
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发表于：2009/08/05 09:40:12 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
最近被要求检验一个蛋白，奇怪的是该蛋白在C4和C18都没有保留的蛋白质，求高手帮忙分析下，具体情况如下：

流动相A:水；流动相B:乙腈。利用TFA和三乙胺调整pH,分别为3.0，7.0，9.0三组。柱子1用的是AT的SB 300A C18 4.6*150 (分别用PH=3.0和7.0的流动相)，柱子2用的是AT的EXTEND 300A C18 4.6*250(分别用PH=9.0和7.0的流动相)，柱子3用的是费罗门的柱子：Jupiter 300 C4,4.6*150（分别用PH=9.0和7.0的流动相)，。在上述三根柱子上样品均无保留，短柱子2分钟出峰，长柱子3分钟出风，均在溶剂峰前0.1分钟左右出峰。

求高手帮忙分析一下啊，到底是什么原因，应该用什么样的方法处理一下或者更换什么样的流动相使用什么柱子，谢谢了先。

再补充一点，就是乙腈的比例无论是5％－90％的任何一个梯度，该蛋白都会飞快的从柱子里跑出来，PH也不影响。感觉就是蛋白根本不保留。如果用纯乙腈的话，蛋白就会沉到柱子上，呵呵
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huaibeijiayuan
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2009/8/5 9:44:49 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
先把你的方法说出来，详细一点，以前有没有做过，以前是否正常还是现在异常。这样才好帮你。
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yuan_log
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2009/8/5 11:23:30 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢呀，全新的蛋白，分子量56KD,等电点5.6。没什么方法（要自己弄方法），目的是检测样品中目标蛋白的纯度，因为纯化后还会有其他蛋白。我做的时候就是用常规的梯度洗脱，现在的主要问题是目标蛋白会很快的出来（1倍柱体积的样子）。使用流动相PH分别为3.0，7.0，9.0三种洗脱，乙腈比例在5％-90％之间都是一样的，全部是在一倍柱体积左右出峰，倒是杂蛋白老老实实在后面排着队
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wenshaowei-2008
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2009/8/5 16:35:50 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
什么蛋白质的极性这么强啊？
换正相看看
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richies
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2009/8/6 9:07:26 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
会不会是分子量太大了,分子量大了,样品就不会进入多孔硅胶小球,直接在穿透硅胶颗粒,这样就造成出峰特别靠前

我记得300A的柱子一般是用于分子量低于20kD的小分子蛋白分离的,你这个56kD有点大了
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yuan_log
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2009/8/6 9:10:23 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 wenshaowei-2008 发表:
什么蛋白质的极性这么强啊？
换正相看看

还没用过正相呢，老大能不能给点提示，好比用什么样的柱子什么样的流动相
另外蛋白是我们这边设计的一种乙肝核心抗原，据说是有几个强极性区域的。
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wenshaowei-2008
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2009/8/6 13:27:26 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 yuan_log 发表:
原文由 wenshaowei-2008 发表:
什么蛋白质的极性这么强啊？
换正相看看

还没用过正相呢，老大能不能给点提示，好比用什么样的柱子什么样的流动相
另外蛋白是我们这边设计的一种乙肝核心抗原，据说是有几个强极性区域的。

用氨基柱或者氰基柱试试
流动相换成正己烷和水
在使用之前，要用甲醇清洗管路过渡的
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yuan_log
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2009/8/6 15:03:34 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 wenshaowei-2008 发表:
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原文由 wenshaowei-2008 发表:
什么蛋白质的极性这么强啊？
换正相看看

还没用过正相呢，老大能不能给点提示，好比用什么样的柱子什么样的流动相
另外蛋白是我们这边设计的一种乙肝核心抗原，据说是有几个强极性区域的。

用氨基柱或者氰基柱试试
流动相换成正己烷和水
在使用之前，要用甲醇清洗管路过渡的

收到，谢谢了，这就去定柱子。
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蚊 子
wsad8008
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2009/8/6 16:07:56 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 wenshaowei-2008 发表:
原文由 yuan_log 发表:
原文由 wenshaowei-2008 发表:
什么蛋白质的极性这么强啊？
换正相看看

还没用过正相呢，老大能不能给点提示，好比用什么样的柱子什么样的流动相
另外蛋白是我们这边设计的一种乙肝核心抗原，据说是有几个强极性区域的。

用氨基柱或者氰基柱试试
流动相换成正己烷和水
在使用之前，要用甲醇清洗管路过渡的

弱弱的问专家两个问题：正己烷与水能放在一起做流动相吗?互溶吗？一个非极性一个强极性 反相与正相过度是不是用异丙醇吧？
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yuan_log
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2009/8/6 16:40:52 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

偶不懂呢，等着看大家的讨论
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gongwe
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2009/8/6 17:13:44 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
用AQ水柱试试
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