主题：【原创】【第二届网络原创作品大赛】分光光度计应用于口服液中的成分检测

1.1  双黄连口服液的药效作用
关澍男[2]等报道指出双黄连口服液是由金银花、黄芩、连翘组成的纯中药制剂，具有辛凉解表、清热解毒之功效。现代药理学研究表明双黄连制剂能抗多种病原微生物，具有广谱的杀菌作用；并能降低毛细血管的通透性、减少渗出，具有抗炎、抗过敏作用；还可增强机体产生α-干扰素能力，可显著地增强细胞免疫和体液免疫作用，对病毒也具有较强的抑制作用，并能中和细菌产生的内毒素，同时具有抗感染及免疫调节双重作用。临床主要用于细菌和病毒感染引起的感冒、流感以及肺炎、气管炎、扁桃体炎等症，其疗效确切、安全、有效。蒋楠[3]等报道认为其中金银花和连翘合用能产生抗菌范围互补，与青霉素合用金银花能加强青霉素对耐药金葡菌的抗菌作用。连翘抗菌谱广，对G+和G-菌，亚洲甲型流感病毒、鼻病毒-17等有抑制作用。岳朝辉[4]等报道指出金银花和黄芩还能作用机体提高巨噬细胞吞噬功能，并促进淋巴细胞转化，从而达到清除病毒，中止感染目的。双黄连口服液具有的广谱抗菌性使原发性疱疹性口炎患者无需加用抗生素就能有效防止感染。

1.1.1  在小儿上呼吸道感染方面的应用
    上呼吸道感染是儿科常见多发病，其发病率占儿科疾病的首位，若治疗不及时易出现严重并发症，如肺炎、心肌炎、脑炎、脑膜炎等，危及患儿生命。引起上呼吸道感染的病原大多为病毒，目前尚无特效的抗病毒西药制剂。李霞[5]用双黄连口服液治疗上呼吸道感染（感冒及咽炎）患儿，每次1～2支，每日3次，其中感冒患儿疗程3天，急性咽炎患儿疗程5天。结果表明双黄连口服液对患儿退热、止咳及流涕、头痛、咽肿痛的缓解效果较好，感冒和急性咽炎疗效明显优于口服小儿速效感冒片。杨淑清[6]用双黄连口服液治疗小儿上呼吸道感染，1岁以下每次半支，1岁以上每次1支，每日2次，连续服用4～7天，疗效较好。表明双黄连口服液治疗上呼吸道感染效果较好。
1.1.2  在治疗小儿流行性腮腺炎方面的应用
    小儿流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒感染引起一种急性传染病，以儿童多发，传染性强。徐广明等[7]用双黄连口服液治疗该病，与用病毒唑治疗组对比，腮肿大消退时间分别为(86±12)h、(106±14)h，两者差别有显著意义。结果表明双黄连口服液治疗小儿流行性腮腺炎的疗效优于病毒唑，见效快，且服用方便，免除注射之苦，值得基层医院推广使用。
1.1.3  在治疗口腔炎方面的应用
    口腔炎是口腔黏膜的炎症，属临床常见、多发病。徐汉文[8]用双黄连口服液治疗口腔炎，每次20mL，每天3次；对照组用洗必泰含漱液漱口，早晚刷牙后含漱，每次15mL，含1min后吐出。双黄连口服液组有效率为92.48％，对照组有效率为76.67％，有显著性差异（P<0.05），且临床研究过程中未见不良反应。李子莎[9]用双黄连口服液治疗各种临床类型口疮41例，疗效满意。说明双黄连口服液疗效明确，安全可靠，可作为口腔炎的常规用药。
1.1.4  在治疗传染性单核细胞增多症方面的应用
    传染性单核细胞增多症是由EB（Eps Tein-Barr)病毒感染引起的一种急性传染病，以发热、咽喉炎、淋巴结肿大、肝脾肿大、皮疹和外周血中见到较多异常淋巴细胞等为主要表现。西医无特效药物。刘清池等[10]用双黄连口服液治疗，每次2支，每日3次，每周1疗程，连续服用1～3疗程，并配以精心护理，取得了较好的疗效，未见到任何副作用，且用药方便，值得临床推广。
1.1.5  双黄连口服液治疗外感风热感冒   
    姜源新等[11]报导通过临床试验，对422例外感风热感冒患者按3：1比例进行随机对照试验。试验组300例，口服双黄连口服液，每次2支（10mL/支），每日3次，3天为1个疗程；对照组122例，口服清热解毒口服液每次2支（10mL/支），每日3次，3天为1个疗程。结果300例应用双黄连口服液的感冒患者中，痊愈率为24.30％，显效率为65.33％，总有效率为84.66％；对照组清热解毒口服液痊愈率为24.59％，显效率为61.48％，总有效率为84.43％；对照试验结果显示，拟定剂量下，双黄连口服液与清热解毒口服液的综合疗效相当（P>0.05）。双黄连口服液治疗组未见不良反应。
    综上所述，双黄连口服液在临床应用广泛，所治疾病可概括为两大类，一类为感染性疾病，双黄连口服液具有抗菌与抗病毒的双重作用；另一类为免疫功能低下所致双黄连口服液能提高宿主的免疫功能，增强宿主的抗病能力。

1.2  双黄连口服液的不良作用
吕国宝[12]曾报道双黄连致过敏性休克一例，双黄连口服液中三种成分金银花、黄芩、连翘三种中药皆为苦寒之药，服用过量会引起脾胃虚寒，畏寒倦卧，汗出神疲，呕吐腹泻。患者的症状估计与患者对黄芩甙、汉黄芩甙、黄芩新素、皂甙等甙类物质，
及甾醇、β-谷甾醇等醇类物质过敏有关。
杨保国[13]等曾报道指出双黄连口服液发生过敏反应的机理：认为本药作为半抗原瘀血清蛋白结合成主抗原后，导致抗原抗体反应。所以，患者和医药工作者要格外注意。

1.3  提取及纯化工艺
常用的提取方法有：煎煮法、浸渍法、渗漉法。常用纯化方法有水提醇沉淀法和离心分离法。
1.3.1  分离和纯化的目的
1.3.1.1  减少体积，提高有效成分的含量以便适应剂型的需要和提高疗效。
1.3.1.2  增加药物的稳定性（液体制剂中含有树酯、粘液质、胶质、鞣质、蛋白质等，易凝集沉淀）。
1.3.2  提取   
煎煮法[14]是用水作溶剂，将药材加热煮沸一定时间，以提取其所含有效成份的一种常用方法。即蒸煮时间的影响为主要考察指标；
1.3.3  纯化   
水提醇沉淀法是先以水为溶剂提取药材的有效成分，再用不同浓度的乙醇沉淀去除提取液中杂质的方法。水提醇沉工艺[15]是向药材的水浸出液中加入的乙醇液（如70%），由于乙醇的存在改变了水浸出液体系内的溶解度平衡，会有一些沉降物质析出，通过过滤操作将这些物质（认为是杂质）滤除。水提醇沉工艺主要用于口服液剂的部分液体制剂，这些中成药的质量要求中常对药液的澄明度提出要求，而且在检验合格出厂以后的运输、仓储、销售及病人使用的全过程中不得发生药液浑浊，为此采用不同浓度的乙醇的多次醇沉。即水提次数、水提时间、醇沉加醇量、醇的浓度为主要考察指标。

1.4  现状
在口服液生产中，为了提高澄清度，多采用水体醇沉法除去水溶性杂质，但作为口服液中的有效成分可能在醇沉时有损失，故为了更好地控制制剂的生产工艺，保证中药制剂质量，应选择合适的醇沉条件。
迄今为止世界各国上市的医药制剂大多数为口服制剂。这是因为经口制剂(片剂、胶囊或含片等等)有不少优点，主要是携带方便且易于服用。但对儿童或老年病人等吞咽固体制剂有困难的特殊人群（约占病人总数的1/4）来说，口服液体药剂几乎更受欢迎。但液体药剂如溶液剂存在普遍性问题是，绝大部分化学合成药的味道极苦，从而使该类患者望药生畏，难以坚持服药。如何改善苦味药物在加工成液体药剂的口感，使多数病人乐于接受，向来是制剂科学家面临的重要课题。

2  材料与方法
2.1  实验材料
2.1.1  药材
表1  药材列表 见附件1
2.1.2  仪器
表2  仪器列表 见附件1
2.1.3  试剂
表3  试剂列表 见附件1
附件1

2.2  分析方法的建立
2.2.1  紫外分光光度计定量分析
2.2.1.1  波长的选择
吸取黄芩苷对照品溶液在200nm~400nm作光谱扫描，确定最大吸收波长。
2.2.1.2  标准曲线的绘制
精密称取干燥至恒重的黄芩苷对照品粉末20mg，溶于25mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品原液。再分别精密量取黄芩苷对照品原液用蒸馏水配制成最终浓度为0.016mg/mL、0.02mg/mL﹑0.032mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL的标准溶液，在波长为276nm下测吸光度，以黄芩苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.2.1.3  黄芩苷含量检测
采用紫外分光光度法分别对过滤后的提取液、醇沉后过滤的产品，黄芩的重复性试验，精密度试验，在波长为276nm下测定黄芩苷吸光度，以黄芩苷作为指标来衡量提取、纯化分离工艺的优劣。
2.2.1.4  精密度试验
取0.04mg/mL黄芩苷对照品溶液连续用紫外分光光度计在276nm波长下测其吸光度。
2.2.1.5  供试品的稳定性试验
取双黄连口服液1.0mL，按样品含量测定项下的方法操作的供试品溶液于0、1、2、4、8h测吸光度值。
2.2.1.6.回收率试验
采用加样回收率试验，精密量取已测定含量（含量为0.0163mg）的双黄连口服液1.0mL共五份，精密加入黄芩苷对照品溶液1.0mL五份，其质量分别为0.016mg、0.02 mg、0.032mg、0.04mg、0.08mg，按含量测定项的方法制备供试液，测回收率。

2.2.2  高效液相色谱定量分析
2.2.2.1黄芩苷含量检测
（1）色谱条件与系统适应性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）；检测波长：276nm。柱温：30℃；流速：1mL/min。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于4500。
（2）测定方法
对照品溶液的制备  取黄芩苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇适量，置水浴中振摇使溶解，放置至室温，稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备  精密量取样品溶液，置容量瓶中，加水稀释至一定浓度，摇匀，用0.45μm滤头过滤即得。
测定法  分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液10μL，注入色谱仪，测定，即得。

2.3  制备方法
2.3.1  处方
金银花  50g
黄芩    50g
连翘    100g
共制成  100mL
2.3.2  提取工艺
2.3.2.1  预实验
考虑煎煮对黄芩主成分黄芩苷含量的影响。取黄芩20g，切片，加8倍量的水煎煮1h，煎煮2次，将提取液过滤、浓缩，再将浓缩液定容在100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。将其稀释适当浓度在波长为276nm下测黄芩苷的吸光度。
2.3.2.2  黄芩苷正交实验
称取黄芩20g，依据因素与水平表，按L9(34)正交试验条件表，以黄芩苷为指标，考察煎煮法中溶剂与药品比例、提取时间（h）、提取次数3因素，每个因素设3个水平进行煎煮，煎煮后的提取液滤过，滤液合并，浓缩，用蒸馏水容至100mL容量瓶中，摇匀。精密量取上述样品液稀释后，在已规定波长下测其吸收度值9个。再分别计算黄芩的提取率。
表4  黄芩苷正交试验因素水平表  见附件2
表5  L9(34)正交试验条件表  见附件2
2.3.2.3  重复性试验
称取黄芩50g三份，切片，根据正交实验最佳提取条件重新提取黄芩苷。提取液过滤，滤液合并、浓缩。浓缩液定容稀释至一定浓度，于波长276nm下测定黄芩苷的吸光度。

附件2

2.3.3  纯化工艺
2.3.3.1  醇沉的乙醇浓度的考察
取最佳提取工艺过滤后的浓缩液50mL共3份，定容至100mL。在以上3组浓缩液中分别缓缓加入无水乙醇使乙醇浓度分别达到50%、60%、75%。再分别搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol•L-1HCL溶液调节pH值至2.0。80℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值7.0，挥尽乙醇备用。定容100mL后，测吸光度，得出三组黄芩苷的吸收度值，放置一段时间观察澄清度。通过比较分析，得到黄芩苷的最佳醇沉浓度。
含醇量的公式计算如下：
（Y+X)*a%=X*b%
y——从最佳提取工艺中取出的体积，mL；
x——从无水乙醇取出的体积，mL；
a%——混合溶液要达到的含醇量；
b%——所用乙醇的含醇量；是无水乙醇，为1。
2.3.3.2  醇沉次数的考察
各取50mL上述黄芩提取工艺过滤后的浓缩液于3个烧杯中。并在80℃时向三个烧杯中分别加入2mol•L-1HCL溶液适量调节pH值至1.0～2.0，保温1小时，静置12小时，滤过，沉淀加6～8倍量水，用40%NaOH溶液调节pH值至7.0。再分别加适量无水乙醇，使三杯混合液含醇量分别达到75%、60%、50%，搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol•L-1HCL溶液调节pH值至2.0。80℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值7.0，回收乙醇备用；将乙醇浓度为75%的样品溶液定容至100mL，测吸光度；再把它静置一段时间观察其澄清度。第二份进行二次醇沉重复以上步骤使乙醇浓度从60%变为75%，定容至100mL，测吸光度；静置一段时间观察其澄清度。同时第三份也进行二次醇沉使乙醇浓度从50%变为60%后，再进行第三次醇沉使乙醇浓度从60%变为75%后，定容至100mL，测定黄芩苷的吸光度，静置一段时间观察其澄清度。