主题：【求助】孔雀绿与孔雀石绿是不是同一种物质？

孔雀绿与孔雀石绿是同一种物质，但孔雀石是另外一种物质。

康林编号：klz0503
（国家标准号：SC/T 3021—2004）
2004 年1 月7 日发布2004 年3 月1 日实施
中华人民共和国农业行业标准
水产品中孔雀石绿残留量的测定
------液相色谱法
1、范围
本标准规定了水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量的液相色谱测定方法。
本标准适用于水产品可食部分中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量的检测。
2、规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改
单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使
用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3、术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
孔雀石绿malachite green ( 康林公司货号：38978-100ml)
属于三苯甲烷染料类，分子式为C23H25ClN2，绿色结晶体。
注：孔雀石绿的结构式见附录A。
3.2
无色孔雀石绿 leucomalachite green（康林公司货号：125660-5G）
N，N—二甲基苯胺，孔雀石绿在水生生物体中的主要代谢产物，分子式为C23H26N2 。
注：无色孔雀石绿的结构式见附录A。
4、原理
以乙酸胺盐溶液和乙腈提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿后，经过液一液萃取，固相萃取，用接
有氧化柱的C18 柱进行高效液相色谱分析，外标法定量。
5、试剂
5.1 所有试剂应无干扰峰，应选择优级纯或色谱纯的试剂，分析纯试剂应重蒸。
5.2 孔雀石绿及无色孔雀石绿标准品：孔雀石绿纯度≥90％，无色孔雀石绿纯度≥90％。
5.3 乙腈（康林公司货号：KLH302）：色谱纯。
5.4 二氯甲烷（康林公司货号：KLH310）分析纯。
5.5 盐酸羟胺溶液（来电咨询康林公司）：0.25g/mL。
5.6 二甘醇（来电咨询康林公司）：分析纯。
5.7 乙酸铵溶液（来电咨询康林公司）：0.1mol/L(pH4.5)，0.125mol/L(pH4.5)。
5.8 对甲苯磺酸溶液：0.05mol/L。
5.9 碱性氧化铝（来电咨询康林公司）：分析纯，粒度0.071mm～0.150mrn。
5.10 中性氧化铝（来电咨询康林公司）：分析纯，粒度0.07mm～0.150mm。
5.11 丙基磺酸阳离子树脂（来电咨询康林公司）：PRS(propylsulfonic acid)，40μm。
5.12 孔雀石绿标准溶液：准确称取孔雀石绿0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL 容量瓶中，使成浓度为
1mg/mL 的标准溶液，再用乙腈稀释成0.1lμg/mL 的工作溶液。该溶液应避光保存。
5.13 无色孔雀石绿标准溶液：准确称取无色孔雀石绿0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL 容量瓶中，使
成浓度为1mg/mL 的标准溶液，再用乙腈稀释成0.1μg/mL 的工作溶液。该溶液应避光保存。
5.14 二氧化铅：分析纯。
5.15 硅藻土（康林公司提供）：精制工业硅藻土。
5.16 水：应符合GB/T 6682 的要求。
6、仪器
6.1 高效液相色谱仪：配可变波长检测器。
6.2 电子天平：感量0.0001g。（康林公司提供请来电咨询）
6.3 匀浆机。
6.4 离心机（康林公司提供国产和进口，请来电咨询）。
6.5 振荡器（康林公司提供国产和进口，请来电咨询）。
6.6 旋转蒸发器（康林公司提供国产和进口，请来电咨询）。
6.7 固相萃取柱：PRS 柱，中性氧化铝柱（来电咨询康林公司）。
6.8 色谱柱:C18 柱（康林公司货号：504971）。
6.9 柱后氧化柱:柱内填料:二氧化铅:硅藻土=1∶1。
7、操作方法
7.1 样品处理
7.1.1 取样
鱼去鳞、皮，沿背脊取肌肉；虾去头、壳，取可食肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。所取样品切为
不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm 的小、块后混匀。
7.1.2 称取样品10g～20g(精确到0．001g)，置于匀浆杯中，向杯中依次加3mL 盐酸羟胺溶液、5mL 对甲
苯磺酸溶液和20mL 0.1mol/L 的乙酸铵溶液，匀浆2min，转移到250mL 三角瓶中，用60mL 乙腈洗涤匀
浆杯，洗涤液合并到三角瓶中，加入20g 碱性氧化铝，用振荡器振荡5min，转移至4 支50mL 离心管内，
30mL 乙腈洗涤三角瓶后转移到离心管中，4 000r/min 离心15min。
7.2 分离纯化
7.2.1 液一液萃取
7.2.1.1 将离心管上清液移入分液漏斗中，向离心管中加入乙腈，洗涤，离心(4 000r/min，15min)，合并上
清液到分液漏斗中，并加入100mL 水、50mL 二氯甲烷和2mL 二甘醇，剧烈振摇分液漏斗，静置1 h。
7.2.1.2 用蒸发瓶收集下层液体后，再往分液漏斗加入50mL 二氯甲烷，振摇，静置约10min，待其分层后
收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35℃下减压旋转蒸发(注意：开始时温度不要直接升到35℃，以
免爆沸)至体积约2mL～3mL。
7.2.2 固相柱萃取
7.2.2.1 固相柱制备
采用中性氧化铝(1g)、PRS 填料(0.5g)分别装填两只固相萃取柱，按中性氧化铝柱在前、PRS 柱在后的
顺序将两柱串联。
7.2.2.2 上样
使用前用5mL 乙腈预洗两柱，然后将7.2.1.2 浓缩液体加入5mL 乙腈混匀后，缓慢加入中性氧化铝柱
内(注意：不要引起柱表面填料浮动。)再用5mL 乙腈洗涤蒸发瓶两次，两次洗涤液均加入柱内，最后用5mL
乙腈洗涤两柱。
7.2.2.3 洗脱收集
弃去中性氧化铝柱，用2mL 水洗PRS 柱，洗脱液弃去；加入0.5mL 乙腈：乙酸铵溶液(0.1mol/L，
pH4.5)=1∶1，洗脱液弃去；再加人2mL 乙腈：乙酸铵溶液(0.1mol/L，pH4.5)＝1∶1，收集该洗脱组分，
定容到2mL，经聚四氟乙烯膜(孔径0.45um)过滤，待上机分析。
7.3 样品测定
7.3.1 测定条件
7.3.1.1 色谱柱：C18 柱，250mm×4.6mm（康林公司Discovery C18 ，货号：504971）；柱后氧化
柱:35mm×4.6mm。
7.3.1.2 流动相：乙腈（康林公司货号：KLH302）:乙酸铵溶液(0.125mol/L，pH4.5)=80∶20；流速：2mL/min。
7.3.1.3 柱温：35℃。
7.3.1.4 进样量：50μL。
7.3.1.5 检测波长：588nm 或618nm。
7.3.2 色谱分析
分别注入50μL 浓度为0.1μg/mL 的孔雀石绿溶液、无色孔雀石绿工作溶液及样品提取溶液于液相色谱
仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准样
品的保留时间定性，外标法定量。标准品色谱图见附录B。
8、结果
8.1 计算
样品中孔雀石绿、无色孔雀石绿的含量按公式(1)计算。
* *1000
* *
A m
A C V
X
S
= s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)
式中：
X——样品中孔雀石绿(无色孔雀石绿)含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
Cs——标准溶液中孔雀石绿(无色孔雀石绿)含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；
A 试样液中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的峰面积；
V——样品提取物溶液体积，单位为毫升(mL)；
As——标准溶液中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的峰面积；
m——样品重量，单位为克(g)。
8.2 方法回收率 本方法的回收率≥70％。
8.3 方法检测限 本方法检测限：孔雀石绿为2μg/kg；无色孔雀石绿为4μg/kg。
8.4 批间方法变异系数 本方法变异系数≤15％。
8.5 方法的线性范围 本方法的线性范围：孔雀石绿标准液0.01 μg/mL～0.40 μg/mL；无色孔雀石绿标准
液0.02μg/mL～0.40μg/mL。
附 录 A
(资料性附录)
孔雀石绿和无色孔雀石绿的结构式

3.2
无色孔雀石绿 leucomalachite green（康林公司货号：125660-5G）
N，N—二甲基苯胺，孔雀石绿在水生生物体中的主要代谢产物，分子式为C23H26N2 。
注：无色孔雀石绿的结构式见附录A。
4、原理
以乙酸胺盐溶液和乙腈提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿后，经过液一液萃取，固相萃取，用接
有氧化柱的C18 柱进行高效液相色谱分析，外标法定量。
5、试剂
5.1 所有试剂应无干扰峰，应选择优级纯或色谱纯的试剂，分析纯试剂应重蒸。
5.2 孔雀石绿及无色孔雀石绿标准品：孔雀石绿纯度≥90％，无色孔雀石绿纯度≥90％。
5.3 乙腈（康林公司货号：KLH302）：色谱纯。
5.4 二氯甲烷（康林公司货号：KLH310）分析纯。
5.5 盐酸羟胺溶液（来电咨询康林公司）：0.25g/mL。
5.6 二甘醇（来电咨询康林公司）：分析纯。
5.7 乙酸铵溶液（来电咨询康林公司）：0.1mol/L(pH4.5)，0.125mol/L(pH4.5)。
5.8 对甲苯磺酸溶液：0.05mol/L。
5.9 碱性氧化铝（来电咨询康林公司）：分析纯，粒度0.071mm～0.150mrn。
5.10 中性氧化铝（来电咨询康林公司）：分析纯，粒度0.07mm～0.150mm。
5.11 丙基磺酸阳离子树脂（来电咨询康林公司）：PRS(propylsulfonic acid)，40μm。
5.12 孔雀石绿标准溶液：准确称取孔雀石绿0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL 容量瓶中，使成浓度为
1mg/mL 的标准溶液，再用乙腈稀释成0.1lμg/mL 的工作溶液。该溶液应避光保存。
5.13 无色孔雀石绿标准溶液：准确称取无色孔雀石绿0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL 容量瓶中，使
成浓度为1mg/mL 的标准溶液，再用乙腈稀释成0.1μg/mL 的工作溶液。该溶液应避光保存。
5.14 二氧化铅：分析纯。
5.15 硅藻土（康林公司提供）：精制工业硅藻土。
5.16 水：应符合GB/T 6682 的要求。
6、仪器
6.1 高效液相色谱仪：配可变波长检测器。
6.2 电子天平：感量0.0001g。（康林公司提供请来电咨询）
6.3 匀浆机。
6.4 离心机（康林公司提供国产和进口，请来电咨询）。
6.5 振荡器（康林公司提供国产和进口，请来电咨询）。
6.6 旋转蒸发器（康林公司提供国产和进口，请来电咨询）。
6.7 固相萃取柱：PRS 柱，中性氧化铝柱（来电咨询康林公司）。
6.8 色谱柱:C18 柱（康林公司货号：504971）。
6.9 柱后氧化柱:柱内填料:二氧化铅:硅藻土=1∶1。
7、操作方法
7.1 样品处理
7.1.1 取样
鱼去鳞、皮，沿背脊取肌肉；虾去头、壳，取可食肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。所取样品切为
不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm 的小、块后混匀。
7.1.2 称取样品10g～20g(精确到0．001g)，置于匀浆杯中，向杯中依次加3mL 盐酸羟胺溶液、5mL 对甲
苯磺酸溶液和20mL 0.1mol/L 的乙酸铵溶液，匀浆2min，转移到250mL 三角瓶中，用60mL 乙腈洗涤匀
浆杯，洗涤液合并到三角瓶中，加入20g 碱性氧化铝，用振荡器振荡5min，转移至4 支50mL 离心管内，
30mL 乙腈洗涤三角瓶后转移到离心管中，4 000r/min 离心15min。
7.2 分离纯化
7.2.1 液一液萃取
7.2.1.1 将离心管上清液移入分液漏斗中，向离心管中加入乙腈，洗涤，离心(4 000r/min，15min)，合并上
清液到分液漏斗中，并加入100mL 水、50mL 二氯甲烷和2mL 二甘醇，剧烈振摇分液漏斗，静置1 h。
7.2.1.2 用蒸发瓶收集下层液体后，再往分液漏斗加入50mL 二氯甲烷，振摇，静置约10min，待其分层后
收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35℃下减压旋转蒸发(注意：开始时温度不要直接升到35℃，以
免爆沸)至体积约2mL～3mL。
7.2.2 固相柱萃取
7.2.2.1 固相柱制备
采用中性氧化铝(1g)、PRS 填料(0.5g)分别装填两只固相萃取柱，按中性氧化铝柱在前、PRS 柱在后的
顺序将两柱串联。
7.2.2.2 上样
使用前用5mL 乙腈预洗两柱，然后将7.2.1.2 浓缩液体加入5mL 乙腈混匀后，缓慢加入中性氧化铝柱
内(注意：不要引起柱表面填料浮动。)再用5mL 乙腈洗涤蒸发瓶两次，两次洗涤液均加入柱内，最后用5mL
乙腈洗涤两柱。
7.2.2.3 洗脱收集
弃去中性氧化铝柱，用2mL 水洗PRS 柱，洗脱液弃去；加入0.5mL 乙腈：乙酸铵溶液(0.1mol/L，
pH4.5)=1∶1，洗脱液弃去；再加人2mL 乙腈：乙酸铵溶液(0.1mol/L，pH4.5)＝1∶1，收集该洗脱组分，
定容到2mL，经聚四氟乙烯膜(孔径0.45um)过滤，待上机分析。
7.3 样品测定
7.3.1 测定条件
7.3.1.1 色谱柱：C18 柱，250mm×4.6mm（康林公司Discovery C18 ，货号：504971）；柱后氧化
柱:35mm×4.6mm。
7.3.1.2 流动相：乙腈（康林公司货号：KLH302）:乙酸铵溶液(0.125mol/L，pH4.5)=80∶20；流速：2mL/min。
7.3.1.3 柱温：35℃。
7.3.1.4 进样量：50μL。
7.3.1.5 检测波长：588nm 或618nm。
7.3.2 色谱分析
分别注入50μL 浓度为0.1μg/mL 的孔雀石绿溶液、无色孔雀石绿工作溶液及样品提取溶液于液相色谱
仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准样
品的保留时间定性，外标法定量。标准品色谱图见附录B。
8、结果
8.1 计算
样品中孔雀石绿、无色孔雀石绿的含量按公式(1)计算。
* *1000
* *
A m
A C V
X
S
= s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)
式中：
X——样品中孔雀石绿(无色孔雀石绿)含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
Cs——标准溶液中孔雀石绿(无色孔雀石绿)含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；
A 试样液中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的峰面积；
V——样品提取物溶液体积，单位为毫升(mL)；
As——标准溶液中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的峰面积；
m——样品重量，单位为克(g)。
8.2 方法回收率 本方法的回收率≥70％。
8.3 方法检测限 本方法检测限：孔雀石绿为2μg/kg；无色孔雀石绿为4μg/kg。
8.4 批间方法变异系数 本方法变异系数≤15％。
8.5 方法的线性范围 本方法的线性范围：孔雀石绿标准液0.01 μg/mL～0.40 μg/mL；无色孔雀石绿标准
液0.02μg/mL～0.40μg/mL。

看看啊,就是这个

是同一种物质的不同盐,孔雀绿的分子式为2C23H25N2.3C2H2O4(出自中国药典二部)http://chemicalland21.com/specialtychem/finechem/MALACHITE%20GREEN%20OXALATE.htm
孔雀石绿的分子式为C23H25CLN2(天津市光复精细化工研究所)http://en.wikipedia.org/wiki/File:Malachite_green.svg