主题：【分享】反反相色谱与HILIC柱的比较 文章——两种分离模式的比较：亲水相互作用色谱HILIC 与反反相色谱ANP

好不容易翻译过来的，如果有错，请大家原谅。

两种分离模式的比较：亲水相互作用色谱HILIC 与反反相色谱ANP
Joseph Pesek，Maria T. Matyska
Department of Chemistry, San Jose State University, San Jose, California
Please direct correspondence to Joseph Pesek at pesek@sjsu.edu



在文献（1）及其他很多文献中，经常可以看到两种相似的色谱分离机理的色谱柱，一种是亲水相互作用色谱（hyd rophilic interaction liquid chromatography，HILIC），另外一种是水相正相色谱（aqueous normal phase，ANP，也称反反相色谱）。但是，事实上这两种色谱柱在保留模式上是不一样的。 本文旨在对HILIC 和ANP 色谱机理做一个准确的定义并对何时使用哪种色谱柱做一个明确的指导。

实验部分
实验所使用的色谱柱为UDC Cholesterol（75mm×4.6mm）及Bidentate C18（BD C18，150mm×4.6 mm 或20 mm×2.0 mm）来自于MicroSolv Technology （Eatontown，New Jersey）。流动相中的乙腈来自于B&J（Muskegon，Michigan），水使用来自Milli-Q 仪器（Millipore，Bedford，Massachusetts）。甲酸购自Spectrum Chemical（Gardena，California）。HPLC为安捷伦1050 型，配有自动进样器和二极管阵列检测器（Wilmington，Delaware）。样品浓度范围为0.1-1mg/mL，进样量为1-5μL。反反相实验中的流动相含有0.1%甲酸。

结果与讨论
HILIC: 亲水色谱是专为保留和分离极性-离子型化合物所设计的一类色谱柱。 在反相色谱中极性-离子型化合物是在死体积附近被洗脱的，即不在反相柱上保留，所以对此类物质的分析是很困难的。在反相色谱上开发方法时，很重要的需求就是物质要在固定相上有保留，并且防止/减少硅胶表面硅羟基对化合物的吸附。为了使极性-离子型化合物能在反相柱上保留，我们经常会对化合物进行衍生（2）或使用离子对试剂（3）。在前一种方法中需要将极性-离子型化合物化学衍生为疏水性物质，而在后一种方法中则在流动相中加入带相反电荷的物质，使极性-离子型化合物变为中性物质。这两种技术不但比较繁琐和费时，特别是离子对技术会导致反相色谱不能与质谱（MS）及光散射检测联用，对实验造成很大限制。

最近发展出来的硅胶制造技术可以使得固定相更适合极性化合物的保留（1）。硅羟基能在一定流动相条件下对极性化合物产生保留。另外一种方法就是对硅胶表面进行化学修饰，如图1 所示。



如果R 基团具有极性，如氰基（-CN），氨基（-NH2） 或二醇（-CH(OH)-CH2-OH），这样固定相就具有保留亲水化合物的能力。使用前一种典型的HILIC 柱对极性化合物的保留性质如图2a 所示。 在低有机相比例（高水相比例）时，亲水性化合物没有保留，因为亲水化合物更倾向于留在流动相中。当流动相的非极性最够强时（足够的有机相比例），极性化合物才会有保留。但是，典型的疏水化合物在HILIC 柱子上却没有保留。因此HILIC 柱可以分析一些极性化合物的混合样，但是当样品中既有极性化合物，又有非极性化合物时，极性化合物就会因没有保留而分不开。



一个用HILIC 柱子分离极性化合物的例子如图2c 所示（4）。显然这两种极性化合物在普通C18 柱上是没有保留的（Figure 2b）。如果分析对象只有极性化合物HILIC 柱子是很合适的选择，就像我们在图2b 和2c 中看到的一样。



ANP，反反相: 尽管HILIC 柱通常能解决极性-离子型化合物的保留问题，但是却不能满足样品中同时有亲水和疏水物质存在的分析要求。事实上，反相柱也一样不能解决亲水、疏水同时存在的情况。但是，反反相（ANP）的柱子就可以解决亲水、疏水物质同时分离的难题，使色谱工作者不至于在反相与HILIC 柱之间做二选一的选择。

“水相正相色谱，反反相”反映了这种柱子具有两种分离机制，这个名字说明反反相（ANP）具有流动相中含水的性质（反相分离机理），同时也具有正相色谱的保留机理（在流动相极性更弱情况下保留增加）。HILIC 柱只提供类似于正相的效果，单没有反相色谱的功能。事实上，ANP 的保留机理与反相与HILIC 有很大差异，接下来的章节就ANP 的分离效果进行论述。
ANP 1: 图3a 展示了两种物质在ANP 柱上的保留图（一个在反相上有保留，一个在正相上有保留）。在此例中，两种保留机理显示的很清楚，并且区域是两种化合物都有保留的。在这种情况下，只要改变流动相就可以在反相色谱与正相色谱间进行转换。流动相中水的比例高，疏水物质被保留，而亲水物质不保留；流动相中有机溶剂比例高，亲水物质被保留，而疏水物质不保留。



图3b 显示了3 种化合物在高水相比例中的分离（反相机理）。在这个例子里，ANP 柱的分离行为就如同一根普通的反相柱。

ANP 2: 图4a 显示了ANP 柱从两种物质得到的保留图的另外一种性质，在这种情况下，流动相的组成使得两类化合物都有很强的保留能力，这样极性和非极性化合物就可以同时在ANP 柱上实现分离。另外一种操作就是我们可以在分析亲水和疏水化合物时使用梯度洗脱的方法。与HILIC 柱相比（只有极性化合
物在高有机相情况下保留）或者ANP1 情况（化合物的保留取决于有机相比例）ANP2 则提供了独特的分离能力，这种分离能力在商品化柱子中是很少见的。
图4b 显示了在ANP2 洗脱模式下分离混合物的例子，两个化合物，一个是极性的（甲福明二甲双胍，Metformin），另外一个是非极性的（格列本脲，Glyburide）在Si-H 基础上的C18柱上的分离。在上图中流动相为50:50（乙腈：水），反相机理起主要作用，格列本脲的保留比极性化合物甲福明二甲双胍更强。中间的图是流动相比例为80:20（乙腈：水），正相机理强于反正机理，甲福明二甲双胍在格列本脲之后被洗脱（使用LCMS 确认）。当乙腈比例继续提高到85%，正相机理就会起主要作用，强极性的甲福明二甲双胍保留时间会比格列本脲长更多。


ANP 3: 第三种分离模式如图5 所示，分析物为两性物质，这类物质多为大分子物质，而且同时含有一个/多个疏水及亲水基团，例如一些多肽或蛋白。在这种情况下，色谱工作者可以根据混合物中分析物的性质选择使用反相还是ANP 模式来进行分离。这一非同一般的能力为实验条件提供了很大的改变空间。

图5b 提供的是一个化合物在不同流动相组成比例条件下按反相和正相机理进行保留的结果。这一系列色谱图的结果和图5a 中所预示的结果是一致的。与预期一致的是，当乙腈比例增加时，保留时间由一个最小值，这个最小值就是保留机理从反相变为ANP 的临近点。



具有ANP 保留性质的色谱柱: 最近，已经有使用Si-H 表面的固定相色谱柱开始使用（MicroSolv 公司的TYPE-C Silica 柱），这种色谱柱显示出具有我们之前所论述的ANP 性质和分离能力，如图3b，4b 和5b 所示，也同时被文献（5，6）所报道。TYPE-C Silica 色谱柱固定相表面的组成与普通色谱柱的差异如图6 所示（Si-H 键的覆盖率为95%）。

目前，与HILIC 柱一样，反反相的机理还不是完全清楚。TYPE-C Silica 这种Si-H 型固定相还具有其他优异性质：可以不需要从流动相中完全去除水就可以进行正相色谱操作；使用100%水相洗脱也不会产生柱子崩塌；1 分钟之内就可以完成梯度洗脱的再平衡（standard or inverse）。这些优点是与HILIC 柱子相比较而言的，水分子会在HILIC 固定相表面形成水膜（1）,而在TYPE-C Silica 的Si-H 表面，由于其强疏水性而不会形成水膜。因此，对TYPE-C Silica 而言不需要相HILIC 柱一样要用水进行清洗。


结论
HILIC 柱被设计用来分离极性化合物；具有反反相功能的TYPE-C Silica 柱则可以用来同时分离极性与非极性化合物。TYPE-C Silica 柱子对含有亲水和疏水化合物的复杂样品具有更高的分离能力。这种对亲水和疏水物质的双重保留能力使得ANP 柱能够在更宽的流动性范围内进行使用和条件优化，为传统液相难以分离的化合物提供更好的解决方法。

References
(1) P. Hemstrom and K. Ingrum, J. Sep. Sci. 29, 1784–1821 (2006).
(2) S. Soback, J. AOAC Int. 82, 1017–1045 (1999).
(3) B.B. Ba and M.-C. Saux, J. Chromatogr. B 764, 349–362. (2001).
(4) K.M. Peru, S.L. Kuchta, J.V. Headley, and A.J. Cessna, J. Chromatogr. A 1107,152–158 (2006).
(5) J.J. Pesek and M.T. Matyska, LCGC 24(3), 296–303 (2006).
(6) J.J. Pesek and M.T. Matyska, J. Sep. Sci. 30, 637–647 (2007).