主题：【分享】农药残留——啶酰菌胺检测方法

5．标准曲线的制作
    将啶酰菌胺标准品配制成0.05～1 mg/L的丙酮溶液数点，分别注入2μL于gc中，用峰高法或峰面积法绘制成标准曲线。
6．定量试验
    注入2μL试验溶液于gc中，根据5的标准曲线求出啶酰菌胺的含量。
7．测定条件
1） gc
    检测器：FTD或NPD
    柱：甲基硅酮，内径 0.25 mm、长 30m、膜厚0.25μm。
    柱温： 100℃（1分钟）--30℃/分钟-250℃（0分钟）--6℃/分钟--300℃（2分钟）。
    进样器温度：250℃
    检测器温度：280℃
    载气： 氦气 
    保留時间： 约12.2分钟
2）gc/MS
    柱：5%苯基--甲基硅酮，内径 0.25 mm、长 30 mm、膜厚0.25μm。
    柱温： 100℃（1分钟）-30℃/分钟-280℃（5分钟）。
    进样器温度：250℃，
    载气：氦气
    离子化方式源（电压）： EI （70 eV）
    主离子 ( m/z)：342、140
    进样量：1 μL
    保留时间： 约10.4分钟
8．定量限
    0.01 mg/kg

9．注意事项
1） 检测方法概述
    本方法用丙酮从样品中抽出啶酰菌胺，正已烷转溶。经合成硅酸镁柱色谱法净化后，GC（FTD）或者GC（NPD）测定、GC/MS确证。
对于谷类、豆类、种子类、水果、蔬菜，与2001年厚生劳动省告示第56号「苯酮唑、苯醚甲环唑、环丙唑醇、环庚草醚、噻呋灭、四克利、戊唑醇、三唑醇、咯菌清、丙环唑、六那唑和戊菌唑检测方法」相同。
2）注意点
① 用乙腈/ 正己烷提取时，形成乳胶体。用棉花过滤，将乙腈/ 正己烷的液量再各增加50 mL可以减少形成乳胶体。
② 净化不充分时应进一步净化。
a) 十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱(360 mg)
    用甲醇和水各10mL预先洗浄。用10mL甲醇：水(3：7)混合溶液负荷试验溶液，用10mL同样的混合溶液洗浄，弃去流出液后，用20mL甲醇：水(1：1)混合溶液溶出。
b) 活性炭小柱(500 mg)
    用5 mL乙腈：甲苯(3：1)混合溶液预先洗浄。用5mL乙腈：甲苯(3：1)混合溶液负荷试验溶液，用10mL同样的混合溶液溶出。收集全部流出液。
c) 酰胺丙基甲硅烷化硅胶小柱(360 mg)
    用5mL正已烷预先洗浄。用5mL乙醚：正已烷(3：17)混合溶液负荷试验溶液，用5mL同样的混合溶液洗浄，弃去流出液，用25mL乙醚：正已烷(1：1)的混合溶液溶出。
③ 合成硅酸镁柱色谱法，为了与苯酮唑等12种农药检测方法对应，采用丙酮和正己烷(3：7)混合溶液作为溶剂，以啶酰菌胺为对象时，用丙酮：正己烷(3：17)混合溶液可以溶出。
④啶酰菌胺的灵敏度在试验溶液注入前后不稳定时。应采取多次注入试验溶液待灵敏度稳定后再标准溶液等措施。

啶酰菌胺有什么危害？

荷兰输日鲜萝卜检测出啶酰菌胺超标。

輸入時のモニタリング検査の結果、オランダ産生鮮ハツカダイコンから基準値を超えるボスカリド（Boscalid，用途：殺菌剤　基準値：0.01ppm（一律基準））が検出されたと発表した。
この結果を受け、オランダ産だいこん類の根のモニタリング検査の頻度を30％に引き上げると通知。

ボスカリド試験法（農産物）

１．	分析対象化合物 ボスカリド

２．

装置

　アルカリ熱イオン化検出器付きガスクロマトグラフ(GC(FTD))又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ(GC(NPD))
　ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC/MS)

３．	試薬、試液 次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。 ボスカリド標準品　本品はボスカリド98％以上を含み、融点は143～150℃である。

４．

試験溶液の調製

１）抽出
(1)　穀類、豆類及び種実類の場合
　試料10.0 gを量り採り、水20 mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100 mLを加え、3分間ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40 ℃以下で約30 mLに濃縮する。これに10 ％塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、ｎ－ヘキサン100 mL及び 50 mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40 ℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
　この残留物にｎ－ヘキサン30 mLを加え、ｎ－ヘキサン飽和アセトニトリル30 mLで3回振とう抽出する。抽出液を合わせて、40 ℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にｎ－ヘキサン5 mLを加えて溶かす。
(2)　果実及び野菜の場合
　試料20.0 gを量り採り、アセトン100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40 ℃以下で約30 mLに濃縮する。これに10 ％塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、ｎ－ヘキサン100 mL及び50 mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40 ℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にｎ－ヘキサン5 mLを加えて溶かす。
(3)　植物油(精製)の場合
　試料2.5 gを量り採り、ｎ－ヘキサン30 mLを加え、ｎ－ヘキサン飽和アセトニトリル30 mLで3回振とう抽出する。抽出液を合わせて、40 ℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にｎ－ヘキサン5 mLを加えて溶かす。
(4)　干しぶどうの場合
　試料に等量の水を加えて磨砕し、試料10.0 g相当を量り採る。これにアセトン100 mLを加え、3分間ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、水10 mL及びアセトン50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40 ℃以下で約30 mLに濃縮する。これに10 ％塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、ｎ－ヘキサン100 mL及び 50 mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40 ℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にｎ－ヘキサン5 mLを加えて溶かす。
２）精製
　クロマトグラフ管(内径15 mm)に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム10 gをｎ－ヘキサンに懸濁させて充てんし、上に無水硫酸ナトリウム5 gを積層する。このカラムに、1) で得られた溶液を注入した後、アセトン・ｎ－ヘキサン混液(1:19)100 mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン・ｎ－ヘキサン混液(3：7)100 mLを注入し、溶出液を40 ℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトンに溶解し、穀類、豆類及び種実類の場合は正確に2 mL、果実及び野菜の場合は正確に4 mL、植物油(精製)の場合は正確に0.5 mL、干しぶどうの場合は正確に2 mLとしたものを試験溶液とする。

５．

検量線の作成

　ボスカリド標準品の0.05～1 mg/Lアセトン溶液を数点調製し、それぞれ2 μLをGCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．	定量 試験溶液2 μLをGCに注入し、５の検量線でボスカリドの含量を求める。

７．

測定条件

１）GC
　検出器： FTD又はNPD
　カラム：メチルシリコン、内径0.25 mm、長さ30 m、膜厚0.25 μm
　カラム温度：100 ℃(1分)－30 ℃/分－250 ℃(0分)－6 ℃/分－300 ℃(2分)
　注入口温度：250 ℃、検出器温度：280 ℃
　キャリヤーガス：ヘリウム
　保持時間：約12.2 分
２）GC/MS
　カラム：5 ％フェニル－メチルシリコン、内径0.25 mm、長さ30 m、膜厚0.25 μm
　カラム温度：100 ℃(1分)－30 ℃/分－280 ℃(5分)
　注入口温度：250 ℃
　キャリヤーガス：ヘリウム
　イオン化モード(電圧)：EI (70 eV)
　主なイオン(m/z)：342、140
　注入量： 1 μL
　保持時間：約10.4 分

８．	定量限界 0.01 mg/kg

９．

留意事項

１）試験法の概要
　ボスカリドを試料からアセトンで抽出し、ｎ－ヘキサンに転溶する。合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで精製した後、GC(FTD)又はGC(NPD)で測定し、GC/MSで確認する方法である。
　穀類、豆類、種実類、果実、野菜については、平成13年厚生労働省告示第56号「カフェンストロール、ジフェノコナゾール、シプロコナゾール、シメトリン、チフルザミド、テトラコナゾール、テブコナゾール、トリアジメノール、フルジオキソニル、プロピコナゾール、ヘキサコナゾール及びペンコナゾール試験法」に同じである。
２）注意点

(1)	アセトニトリル/ｎ－ヘキサン分配では、ダイズでエマルジョンを形成した。綿栓ろ過や、液量を各50 mLに増量することでエマルジョンの低減が可能である。
(2)	精製が不十分な場合は以下の精製を追加することができる。 a)　オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(360 mg) 　メタノール及び水各10 mLで予備洗浄を行う。試料液をメタノール・水混液(3：7)10 mLで負荷、同混液10 mLで洗浄し、流出液を捨てた後、メタノール・水混液(1：1)20 mL で溶出させる。 b)　活性炭ミニカラム(500 mg) 　アセトニトリル・トルエン混液(3：1)5 mLで予備洗浄を行う。試料液をアセトニトリル・トルエン混液(3：1)5 mLで負荷、同混液10 mLで溶出させる。全量を採取する。 c)　アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360 mg) 　ｎ－ヘキサン5 mLで予備洗浄を行う。試料液をエーテル・ｎ－ヘキサン混液(3：17)5 mLで負荷、同混液5 mLで洗浄し、流出液を捨てた後、エーテル・ｎ－ヘキサン混液(1：1)25 mLで溶出させる。
(3)	合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーでは、カフェンストロール等12農薬分析法に対応できるように、溶出溶媒としてアセトン・ｎ－ヘキサン混液(3：7)を採用しているが、ボスカリドのみを対象とする場合は、アセトン・ｎ－ヘキサン混液(3：17)でも溶出可能である。
(4)	ボスカリドの感度が試験溶液の注入の前後で大幅に変動する場合がある。試験溶液を数回注入し、感度を十分に安定させてから標準溶液を注入する等の措置が必要である。

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参考文献

　平成13年厚生労働省告示第56号「カフェンストロール、ジフェノコナゾール、シプロコナゾール、シメトリン、チフルザミド、テトラコナゾール、テブコナゾール、トリアジメノール、フルジオキソニル、プロピコナゾール、ヘキサコナゾール及びペンコナゾール試験法」

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類型

C

ボスカリド試験法（畜産物）

１．	分析対象化合物 ボスカリド

２．	装置 ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC/MS)

３．	試薬、試液 次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。 ボスカリド標準品　本品はボスカリド98％以上を含み、融点は143～150℃である。

４．

試験溶液の調製

１）抽出
(1)　筋肉、脂肪、肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合
　筋肉、肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合は、細切均一化した後、その20.0 gを量り採る。
　脂肪の場合は、細切均一化した後、その5.0 gを量り採る。
　これに水20 mLを加え、ホモジナイズしたのち、アセトン・ｎ－ヘキサン混液(1：2)100 mLを加え、さらにホモジナイズし、2,500回転/分で5分間遠心分離する。上澄液を200 mLの三角フラスコに分取する。遠心管内の残留物にｎ－ヘキサン50 mLを加えホモジナイズしたのち、2,500回転/分で5分間遠心分離し、上澄液を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置したのち、あらかじめ重量を測定したすり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで、アセトン・ｎ－ヘキサン混液(1：2)20 mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40 ℃以下で溶媒を除去したのち、残留物の重量を測定し、これを脂肪重量とする。この残留物の全量または一定量を採り、アセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で、抽出脂肪0.50 g/5 mLまたは試料5.0 g/5 mLになるように溶解し、これを抽出溶液とする。
(2)　乳、卵の場合
　試料20.0 gを量り採り、アセトニトリル100 mLを加えてホモジナイズしたのち、2,500回転/分で5分間遠心分離する。上澄液を300 mLの分液漏斗に分取する。遠心管内の残留物にアセトニトリル 50 mLを加えホモジナイズしたのち、2,500回転/分で5分間遠心分離し、上澄液を上記の分液漏斗に合わせる。これに塩化ナトリウム 10 gを加え、振とう機を用いて3分間激しく振り混ぜたのち、静置し、分離した水層を除く。アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器に移し、40 ℃以下で溶媒を除去する。この時水が残らなかった場合には、残留物に少量のアセトン・シクロヘキサン混液(1：4)を加えて超音波抽出する操作を3回繰り返し、抽出液を合わせて試料 5 g/5 mLになるようにしてこれを抽出溶液とする。また、水が残った場合には、酢酸エチル20 mLを加えて残留物を溶解したのち、無水硫酸ナトリウムを加えて超音波抽出する。抽出液をすり合わせ減圧濃縮器中にろ過し、酢酸エチル10 mLを用いて先の減圧濃縮器を洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40 ℃以下で溶媒を除去する。この残留物をアセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で試料 5 g/5 mLになるように溶解し、これを抽出溶液とする。
２）精製
(1)　筋肉、脂肪、乳及び卵の場合
　１）抽出で得られた抽出溶液を3,000回転/分で5分間遠心分離し、その上澄液5 mLをゲル浸透クロマトグラフィー用カラム(ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体カラム)に注入し、アセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で溶出する。58～165 mLに溶出する画分をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40 ℃以下で溶媒を除去する。この残留物にアセトン・n－ヘキサン混液(1：1) 2 mLを加えて溶かす。この溶液をあらかじめアセトン・n－ヘキサン混液(1：1) 10 mLで洗浄したエチレンジアミン－N－プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500 mg)に注入したのち、減圧濃縮器をアセトン・n－ヘキサン混液(1：1) 1 mLで洗い、洗液を先のカラムに注入する操作を3回繰り返す。カラムにアセトン・n－ヘキサン混液(1：1) 15 mLを注入し、全溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40 ℃以下で溶媒を除去する。この残留物をアセトン・n－ヘキサン混液(1：1) 1 mL［脂肪の場合は0.5 mL］に溶解し、これを試験溶液とする。
(2)　肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合
　１）抽出で得られた抽出溶液を3,000回転/分で5分間遠心分離し、その上澄液5 mLをゲル浸透クロマトグラフィー用カラム(ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体カラム)に注入し、アセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で溶出する。58～65 mLに溶出する画分(画分I)を採り、この溶液をあらかじめアセトン・シクロヘキサン混液(1：4) 10 mLで洗浄したエチレンジアミン－N－プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500 mg)に注入したのち、容器をアセトン・シクロヘキサン混液(1：4) 1 mLで洗い、洗液を先のカラムに注入する操作を3回繰り返す。カラムにアセトン・シクロヘキサン混液(1：4) 2 mLを注入し、全溶出液を合わせてすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40 ℃以下で溶媒を除去する。この残留物をn－ヘキサン 1 mLで溶解し、この溶液をあらかじめn－ヘキサン 10 mLで洗浄したシリカゲルミニカラムに注入したのち、減圧濃縮器をn－ヘキサン 1 mLで洗い、洗液を先のカラムに注入する操作を3回繰り返す。カラムにn－ヘキサン 7 mLを注入し、この溶出液は捨てる。次いで、カラムにエーテル・n－ヘキサン混液(1：19) 15 mLを注入し、溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採る。また、別に65～165 mLに溶出する画分(画分II)をその減圧濃縮器中に合わせ、40 ℃以下で溶媒を除去する。この残留物をアセトン・n－ヘキサン混液(1：1) 1 mLに溶解し、これを試験溶液とする。

５．

検量線の作成

　ボスカリド標準品の0.05～1 mg/L(脂肪の場合は0.01～0.2 mg/L)アセトン・ｎ-ヘキサン(1：1)溶液を数点調製し、それぞれ1 μLをGC/MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．	定量 試験溶液1 μLをGC/MSに注入し、５の検量線でボスカリドの含量を求める。

７．	測定条件 GC/MS 　カラム：5 ％フェニル－メチルシリコン、内径0.25 mm、長さ30 m、膜厚0.25 μm 　カラム温度：100 ℃(1分)－30 ℃/分－280 ℃(5分) 　注入口温度：250 ℃ 　キャリヤーガス：ヘリウム 　イオン化モード(電圧)：EI (70 eV) 　主なイオン(m/z)：342、140 　注入量： 1 μL 　保持時間：約10.4 分

８．	定量限界 0.01 mg/kg

９．

留意事項

１）試験法の概要
　ボスカリドを試料からアセトン・ｎ－ヘキサン混液(1：2)で抽出(乳、卵の場合はアセトニトリルで抽出)し、ゲル浸透クロマトグラフィーおよびエチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラムクロマトグラフィーで精製した後、GC/MSで測定、確認する方法である。

２）注意点

(1)	抽出時に上澄液を分取する操作で水を除かない場合は、大量の無水硫酸ナトリウムが必要である。分液漏斗を用いて水層を除去した後に無水硫酸ナトリウムによる脱水を行うとよい。
(2)	ゲル浸透クロマトグラフ条件の例 　　カラム ： ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体(内径20 mm、長さ300 mm)にガードカラム ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体(内径20 mm、長さ100 mm)を接続したもの、または同等品 　　移動相：アセトン・シクロヘキサン混液(1：4) 　　流速：5 mL/min 　　カラム温度：40 ℃ 　　注入量：5 mL 　　モニター波長：254 nm 　　分取範囲 ： 筋肉、脂肪、乳及び卵の場合：58～165 mL(合計107 mL) 肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合 　画分I：58～65 mL(合計7 mL)、画分II：65～165 mL(合計100 mL) 　ゲル浸透クロマトグラフィーは、あらかじめ使用する条件で、指標物質であるアクリナトリンおよびトリシクラゾール、ならびに対象物質ボスカリドの溶出位置を確認し、分取範囲を決定しておく。 分取範囲の確認：アクリナトリン及びトリシクラゾールの5 mg/L混合溶液を移動相で調製し、その5 mLをゲル浸透クロマトグラフに注入して254 nmでモニターし、あらかじめ分取範囲を確認する。溶出液を適当な間隔で分取してGC/MSで測定するなど他の適切な方法を用いてもよい。 　　　a)　筋肉、脂肪、乳及び卵の場合(図1参照) 　　　　　アクリナトリンの保持時間からトリシクラゾールの溶出が終了するまで。 　　　　　(例)58～165 mL(合計107 mL) 図1　筋肉、脂肪、乳及び卵の場合の分取範囲 　　　b)　肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合(図２参照) 　　　　　　画分I：アクリナトリンの保持時間からアクリナトリンの溶出が終了するまで。 　　　　　　画分II：画分Iの分取終了からトリシクラゾールの溶出が終了するまで。 　　　　　　(例)画分I：58～65 mL(合計7 mL)．画分II：65～165 mL(合計100 mL) 図２　肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合の分取範囲
(3)	ミニカラムは使用条件で検討対象農薬の溶出調査を事前に行い、溶出位置を確認してから使用する。なお、エチレンジアミン－N－プロピルシリル化シリカゲルミニカラムでは、ボスカリドを保持しないため、注入液から全ての溶出液を捕集する必要がある。
(4)	GC/MS測定において妨害が見られた場合には、シリカゲルミニカラム(690 mg)による 追加精製を行う。[エーテル・ｎ－ヘキサン混液(1：49)10 mLで予備洗浄。試料液をエーテル・ｎ－ヘキサン混液(1：49)3 mLで負荷、同混液10 mLで洗浄し、次いで、アセトン・ｎ－ヘキサン混液(1：1)20 mLで溶出する。]
(5)	GC/MS測定では、ボスカリドの感度が試料の注入の前後で大幅に変動する場合がある。試料を数本注入し、感度を十分に安定させてから標準溶液を注入する等の措置が必要である。
(6)	脂肪含有量が高い試料では、試験溶液の濃縮倍率が低くなる。その際、目標の測定感度が得られない場合には、抽出脂肪を用いてゲル浸透クロマトグラフィー以降の操作を行い、複数の検液を合わせて試験溶液とする。

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参考文献 なし

12

類型 C

意大利输日小萝卜检测出啶酰菌胺超标。

厚生労働省は、輸入時のモニタリング検査の結果、イタリア産生鮮ラディッシュから基準値を超えるボスカリドが検出されたと発表した。
この結果を受け、イタリア産ラディッシュ及びその加工品（簡易な加工に限る）の残留農薬に係るモニタリング検査の頻度を30％に引き上げて対応すると通知した。（平成24年6月27日）

◆ボスカリド（Boscalid）
　・用途：殺菌剤
　・基準値：0.01ppm（一律基準）

啶酰菌胺 (boscalid)  2012年11月保护期满

新型烟酰胺类杀菌剂--啶酰菌胺

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