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食品毒素/微生物检测

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主题：【分享】细胞培养常见问题解答

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2011/4/29 19:30:10 11楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5.为什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞？

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染？

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。

5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6.重复步骤4。

7.在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。

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2011/4/29 19:32:07 Last edit by 7336167

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2011/4/29 19:31:22 12楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？

GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

10.目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？

Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌体检验

生物化学检测

激素的检测

血红蛋白检测

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2011/4/29 19:32:47 Last edit by 7336167

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2011/4/29 19:33:17 13楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、来源：293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用Ca3(PO4)2转染效率可高达50%。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。

2、形态为上皮细胞，贴壁细胞，能致瘤。

3、染色体核型：亚三倍体人细胞系。染色体众数为64，30%的细胞有64 条染色体。4.2%的细胞染色体数目更多。多数细胞der(1)t(1;15) (q42;q13), der(19)t(3;19) (q12;q13), der(12)t(8;12) (q22;p13),还有四条标记染色体，有的细胞另有5条标记染色体。der(1)与M8 (or Xq+)常常成对出现。N17 与 N22各有四条。值得注意的是多数细胞有三条X染色体，两条Xq+，一条Xp+。

4、293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化细胞。表达转染的腺病毒5的基因。早期报道认为此细胞含有Ad 5基因组左端和右端[RF32764]，现已清楚仅含有左端序列，此细胞系人腺病毒滴度高。室温不贴壁，37℃几日后重新贴壁。表达由整合素beta-1 亚基与玻基结合素受体 alpha-v 亚基组成的玻基结合素细胞表面受体。

5、293:弃培养基，含0.25% 胰酶, 0.03% EDTA 消化液洗涤，弃去，加1-2ml消化液室温或37℃消化。加入新鲜培养基，吸出，分到新培养皿中。一传二至一传四。

293T:生长快，通常倍增时间不到一天。每3~4 天1：10至1：20稀释，5% CO2条件下培养。细胞贴壁疏松，可只用EDTA消化，不要用胰蛋白酶过度消化。

每两到三天换液一次。

6、冻存液：95%培养基；5%,DMSO；

7、培养条件：ATCC培养基：90%的MEM Eagle，加入2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，0.1 mM必需氨基酸，1.0 mM 丙酮酸钠；10%加热灭活的马血清37℃培养。

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2011/4/29 19:35:15 Last edit by 7336167

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2011/4/29 19:34:54 14楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?

答：胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。

2怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件？

答：ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。

3支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

答：不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

4细胞的渗透压耐受性是多少？

答：细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260－320mOsm/kg的范围都适宜。

5培养细胞出现死亡其可能的原因有什么？解决办法有哪些？

答：可能的原因有培养箱内无CO2；培养箱内温度波动太大；细胞冻存或复苏过程中损伤；培养液渗透压不正确；培养液中有毒代谢产物堆积等。

解决办法可以检测培养箱内CO2浓度，检查培养箱内温度；取新的保存细胞种；检测培养液渗透压等；换入新鲜培养液等。

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2011/4/29 19:35:59 Last edit by 7336167

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2011/4/29 19:36:59 15楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

答：冷冻管内细胞数目一般为1-8×106 cells/ml vial。

3如何用台盼兰计数活细胞？

答：将样品适当稀释后，用稀释后的样品和0.4％的台盼兰溶液按1:1混合后，用移液枪点样到血球计数板，置于倒置显微镜下观察、计数，其中蓝色细胞是死细胞，因活细胞排斥台盼兰，不被染色。

4冷冻管应如何解冻？

答：取出冷冻管后，须立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1－2分钟内大部分融化，特别注意，需残留一小块冰块，就可拿到超净工作台操作细胞，用75％消毒冻存管，用新鲜培养基将细胞转移至培养瓶。另外冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

5细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？

答：除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养方瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

6培养细胞时应使用5%还是10%CO2，或者根本没有影响？

答：一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g 时，则应使用5%CO2培养细胞

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2011/4/29 19:37:47 Last edit by 7336167

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2011/4/29 19:38:16 16楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

答：欲回收动物细胞，其离心速率一般为300×g(约1,000rpm)，5-10分钟，过高之转速过长时间都将造成细胞死亡。合适的离心转速是根据相对离心决定。

2悬浮细胞应如何继代处理？

答：一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养瓶中，稀释细胞浓度即可。若培养液太多时可分瓶取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养瓶中，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复上述步骤即可。

3冷冻保存细胞之方法？

答：冷冻保存方法一：冷冻管置于4℃（30－60分钟）→–20℃(30分钟) →–80℃（16－18小时或隔夜）→ 液氮罐长期储存。

冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80℃以下，再放入液氮中长期储存。

4支原体污染会对细胞培养有何影响？

答：支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数、代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

5购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

答：研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，原因比较复杂，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于–80℃太久等。建议严格参照ATCC或ECACC的标准操作规程进行细胞复苏、冻存等工作。

6购买的细胞冷冻管经解冻后，为什么有时会发生细胞数目太少？

答：研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。但对于DMSO敏感的细胞，还是复苏细胞时，用离心去除DMSO比较好

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2011/4/29 19:38:56 Last edit by 7336167

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2011/4/29 19:39:42 17楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1培养液pH对细胞生长的影响？

答：由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：新配制的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

2培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？

答：通常细胞生长得非常快时，pH值通常下降得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。

（1）按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。

（2）改用不依赖CO2培养液。

（3）松开瓶盖1/4 圈。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。

（4）在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。

（5）如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。

3为什么培养的细胞要及时传代？

答：体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长得以继续。

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2011/4/29 19:40:18 Last edit by 7336167

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2011/4/29 19:42:46 18楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

一、细胞冷冻保存

1、材料：

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO（Sigma D-2650）、无菌塑料冷冻保存管（Nalgene　5000-0020）、0.4％（w/v）trypanblue（GibcoBRL15250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机（KRYO10SeriesII）。

2、冷冻保存方法：

（1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

3、步骤：

（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。

（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

4、注意事项：

（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。

（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

（4）冷冻保存之细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。

（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

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二、冷冻细胞活化

1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。

3、材料：37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器。

4、步骤：

（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内（稀释比例为1：10～1：15），混合均匀，放入CO₂培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DMSO或glycerol），依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO₂培养箱培养。

（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

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三、细胞计数与存活测试

1、原理：

（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm²大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm²×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。

2、材料：

0.4%w/vtrypan blue（GibcoBRL15250-061）；Erythosin bluish stain；取0.1gramErythrosin bluish（SigmaE-9259）及0.05gram preservative methylparaben（SigmaH-3647）溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片（Hemocytometerandcoverslip）；计数器（counter）；低倍倒立显微镜；粒子计数器（Coultercounter,CoulterElectronics）。

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