主题：【极限体验&说出你的故事】有关物质检测方法建立简介与实操（5月份）

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发表于：2011/05/28 09:50:13 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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为保证用药安全和有效以及考察生产工艺和质量提供依据并参照中国药典2010年版（二部）、***片国家食品药品监督管理局质量标准***、《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》、《化学药物杂质研究的技术指导原则》、***原料药食品药品监督管理局质量标准***和依据本品的质量研究的试验结果及稳定性试验结果制订本质量标准。
注：“***”为保密而隐藏。
以下为建立该药品的有关物质检查方法过程，希望大家批评指正。
检测方法的选择：
查阅相关资料，并结合本品的原料药的物理化学性质去选择。药品主要主要为有机物，此处的有关物质主要针对有机物。
有机杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法。通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。随着分离、检测技术的发展与更新，高效、快速的分离技术与灵敏、稳定、准确、适用的检测手段相结合，几乎所有的有机杂质均能在合适的条件下得到很好的分离与检测。在质量标准中，目前普遍采用的杂质检测方法主要为高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography； HPLC）、薄层色谱法(Thin Layer Chromatography；TLC)、气相色谱法(Gas Chromatography；GC)和毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis；CE）。应根据药物及杂质的理化性质、化学结构、杂质的控制要求等确定适宜的检测方法。由于各种分析方法均具有一定的局限性，因此在进行杂质分析时，应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证，如HPLC 与TLC 及HPLC 与CE 的互相补充，反相 HPLC系统与正相HPLC 系统的相互补充，HPLC 不同检测器检测结果的相互补充等。
本品选用方法为高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography； HPLC）。
1.试验材料：
色谱仪（DAD检测器）
色谱柱：月旭色谱柱：SN:W10212096；PN：wei518425
2.流动相选择：根据查阅的相关资料初步拟定流动相如下：

流动相体系

编号	流动相	引用相关资料
1	0.05mol/L磷酸***（用磷酸调节pH值为4.0）	***
2	0.18%***-甲醇（95:5）（用磷酸调节pH值为4.5）	***
3	乙腈-水（含0.02mol/L***，用磷酸调节pH值至2.1）（4：96）	***相关研究资料

试验结果典型色谱图见下图。

流动相1（样品）

流动相2（样品）

流动相3（样品）

通过上述试验初步拟订流动相3作为本品有关物质检查用流动相。
根据确定的流动相进行溶剂、空白辅料等试验，并确认无干扰情况。列表统计相关的色谱图参数，如分离度，最大吸收波长，各波长的下主峰的归一化法含量等，理论板数，拖尾因子，保留时间（杂质与主峰的相对保留时间比）。
专属性
为了考察方法能否有效检测出样品中的降解产物，还可根据药物的化学结构特点、制剂的处方与工艺、储存条件等选用合适的酸、碱、光、热、氧化反应等加速破坏性试验来验证分析方法的专属性，采用二极管阵列检测器检测峰的纯度。因为在强制降解试验条件下产生的降解产物较药品货架期产生的降解产物复杂、未知杂质多，分离难度大，上述分析方法可有效地显示各色谱峰的纯度，以免因分离度不符合要求，导致分析结果的不准确。
强制降解试验对于未知杂质的分离度考察是非常必要的，在试验过程中，应注意破坏性试验要适度，应着重考察敏感条件。如产品在一定条件下稳定，则无必要再提高条件的剧烈程度进行重复试验。破坏试验的程度暂无统一要求，一般以强力破坏后杂质占10%～20%左右。
降解试验
A、样品溶液：取样品，按照有关物质供试品浓度配制溶液，进样，记录图谱。
B、高温降解溶液：取样品，按照有关物质供试品浓度配制溶液，于100℃水浴中放置一段时间，加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录图谱。（如果药品比较稳定，可以采用油浴加热或在高压灭菌锅内加热）
C、酸降解溶液：取样品，置量瓶中，加入适量流动相溶解，再加入少量一定浓度盐酸溶液（一般由0.1M开始试验，视药品稳定情况可逐步加大盐酸浓度，最大浓度不得超过6M），常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加同浓度氢氧化钠溶液调节pH值至中性，再加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。
D、碱降解溶液：取样品，置量瓶中，加入适量流动相溶解，再加入少量一定浓度氢氧化钠溶液（一般由0.1M开始试验，视药品稳定情况可逐步加大氢氧化钠溶液浓度，最大浓度不得超过6M），常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加同浓度盐酸溶液调节pH值至中性，再加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。
E、酸碱空白溶液：在量瓶中加入少量一定浓度盐酸溶液，常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加同浓度氢氧化钠溶液调节pH值至中性，再加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。
F、过氧化氢降解溶液：取样品，置量瓶中，加入适量流动相溶解，再加入少量双氧水（一般由5%过氧化氢溶液开始试验，视药品稳定情况可逐步加大过氧化氢溶液浓度，最大浓度不得超过30%），常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。
G、过氧化氢空白溶液：在量瓶中加入少量双氧水，常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间，取出，冷却，加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。
H、强光降解溶液：取样品，除去包装，置于照度为4500lx±500 lx的光照箱内放置10天的，称取适量，置量瓶中，加溶剂稀释至刻度，滤过，进样，记录谱图。
考察主成分峰纯度，应达到98%以上。
通过上述试验，综合考虑，选择合适的波长。
系统适用性
取样品，按照有关物质供试品浓度配制溶液，进样6次，记录图谱。理论板数应符合规定，分离度应大于1.5或符合规定、拖尾因子应0. 8-1. 2或符合规定。
有已知杂质并且杂质对照品可获得的，:配制杂质对照溶液，进样6次，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2. 0%，保留时间的相对标准差应不大于1. 0%。另外，理论板数应符合规定，分离度应大于1.5或符合规定，拖尾因子应为0. 8-1. 2或符合规定。
检测限与定量限
一般采用信噪比法。
基线：用流动相平衡后，取溶剂进样，记录色谱图，进3针。
检测限：取对照品，加溶剂稀释至很小浓度，进样，记录图谱，观察信噪比。信噪比为3：1，为检测限。信噪比10：1，为定量限。分别进3针。
有已知杂质并且杂质对照品可得的，须用已知杂质对照品同时做。杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。
精密度
取1%对照溶液，连续进样6次，记录色谱图。峰面积的相对标准差应不大于2.0%。
已知杂质的线性
取杂质对照品，按测定浓度的 60%, 80%, 100%, 120%、140%的系列溶液。取该系列溶液进样，记录色谱图，计算回归方程。回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内。（共5张图谱）
溶液稳定性
取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8小时进样，记录色谱图，观察主峰峰面积变化并计算RSD，观察是否有新杂质。确定溶液是否稳定，不稳定的应注明立即进样。有已知杂质并且杂质对照品可得的，配成杂质对照溶液进样。
已有已知杂质的回收率
　一般以回收率试验进行验证。无已知杂质的，可不做。
有已知杂质的，须做加样回收试验验证准确度。
例如某杂质的限度为0.2%，取已知杂质含量的样品适量9份，分别杂质适量，稀释到有关物质供试品溶液浓度，使样品中含杂质对照为0. 1%、0. 2%和0. 3% (各三份)（测定浓度的50%、100%、150%）。分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。
方法耐用性试验：一般考察流动相成分比例、流速、柱温和检测波长耐用范围较宽。
典型色谱图见下图：