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液质联用（LCMS）

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主题：【第六届原创】我的质谱方法移植之路

浏览0 回复23 电梯直达

happy爱米粒

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发表于：2011/07/08 12:34:24 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为xgy2005原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

公司刚买了6490，因此最近一直在做仪器方法的移植工作，一百多项兽残项目，从premier移植到6490上，历经个把月，说难不难，说不难过程中还真发生了一些小插曲，一路上装点着我那看似平坦的移植道路，其乐无穷啊，呵呵。
插曲一形态各异的分子离子峰

做质谱方法移植时首先要做的就是扫描母离子，最常见的母离子（正离子模式）一般是化合物加氢峰，根据化合物种类不同还可能形成一定强度的加钠峰、加钾峰、加铵峰甚至加其他的溶剂峰如甲醇和乙腈等。

之前使用的Premier比较常见的都是加氢峰和加铵峰，往6490上移植的时候竟然发现不同设备同一化合物可能会形成不同种类的分子离子峰。

如阿维菌素类和聚醚类药物在premier上加铵峰为最强离子峰，在6490上则形成加钠峰.而青霉素类在6490质谱上全扫描时发现氨苄青霉素、奈夫西林、青霉素V 、青霉素G 四种化合物形成了加甲醇加氢峰33，形成加溶剂峰的根本原因是标准储备液的溶剂问题，因此，建议青霉素标准品最好溶解在乙腈水中，流动相和预处理都避免使用甲醇。

伊维菌素在premier上形成加铵峰，在6490上最强离子峰加钠峰，次强离子峰为加钾峰

盐霉素在premier上形成加铵峰，在6490上形成加钠峰

储备液配制在甲醇水里的青霉素G标准品提取质谱图，最强质荷比367

重新配制在乙腈水离得的青霉素G标准品提取质谱图，最强质荷比335

插曲二都是高灵敏度惹得祸

做质谱方法开发的时候，应根据化合物的灵敏度选择适当浓度的标样，单标更好，可减少离子相同时的干扰同时又减少电离抑制，一般1ppm左右就足够了，万不可大意使用大浓度的标样，污染了设备可是件头疼的事。

往6490上移植呋喃代谢物的时候，因标准品需要衍生，衍生后的标样干扰比较大，为全扫描时能得到更好的信号强度，直接进了大浓度的标样，自动进样，结果污染了设备，跑标准品基线很高，进空白有目标物检出。以前也曾经碰到过很多污染的问题，大多是手动进样时六通阀定量环周围的污染，洗洗六通阀就解决了，因1290使用计量泵而不是定量环精确进样，除load时处于旁路，其余状态均处于主流路，阀内污染的可能性很小。于是网上google了一下，有网友提示质谱污染的几个可能和清洗方法：

如果是在液相进样器进样口污染，把针座拿下来放在甲醇中超声就可以了；

如果是离子源内部污染，可以用无纺布加50％的异丙醇擦洗；

如果是毛细管污染，那就把仪器泄真空后把毛细管拿出，按正确方法清洗毛细管，做好后记得要重新调谐。

当务之急，是先排查哪个环节的污染。先咨询了下安的工程师，一般认为污染到毛细管的可能性比较小，因标准品基线高，所以首先应清洗离子源，然后确认自动进样器的问题，于是用无纺布加50％的异丙醇擦洗离子源后再确认自动进样器是否污染，排查方法如下：

1、将样品进样位置设为-1，短路自动进样系统，质谱检测

2、观察是否有目标物。若有，则说明流动相管路和离子源内部有污染，若无，则说明自动进样系统有污染。

经检测，最终判断自动进样系统进样口污染，于是先松开六通阀6号（to MS）接口，将5号接口（from needle seal）拧下，接到6号接口上，使用80%的甲醇水3ml/min流速反冲针座5min.重新接好六通阀，0μL进样检测进样系统污染已完全消除。

因污染导致基线较高的呋喃标准品TIC

清洗离子源后呋喃标准品TIC,基线平了很多

因污染导致空白有微量目标物

清洗自动进样器针座后全程空白恢复正常

将样品进样位置设为-1，短路自动进样系统时质谱检测信号无目标物

插曲三梯度洗脱的延迟效应

从premier移植到6490，还有一个重要的环节就是液相条件，色谱柱是色谱分离的核心，我们之前一直用waters的色谱柱，而且家里现在存货也很多，现在用安的设备也不想浪费了那些好柱子，因此，想看使用相同的色谱柱，两套系统能不能实现相同保留时间，在不改变原有梯度的条件下，没想到还真让我们做到了，只是在改变了一个流速的条件下，就轻松实现了相同的分离条件，这样就可以直接照搬Aquity上的梯度洗脱条件了，可是省了很多麻烦啊，谁知正当我们窃喜之时，麻烦正不知不觉的悄然而至。

刚开始作方法移植都是单针进样，所以没有发现什么异常，待到批量处理样品时发现第二针的保留时间总是会提前0.2min左右，保留时间靠后的偏0.1min左右，之后所有的样品都与第二针保持一致，因保留时间并不是偏差很大，起初没有注意，只认为是第一针柱未充分平衡，后来发现大部分方法都出现了相同的问题，而且第一针的保留时间才是正常的，于是开始寻找问题的根本原因，原来是两家液相梯度变化曲线不同所致，Aquity梯度曲线一共有12种变化可选，通常在洗脱后回到初始比例的时候我们都会选择“1”，最快时间回到初始比例，而1290液相不支持多种曲线，只能是线性“6”变化，因此导致后运行时间不够，系统未完全平衡到初始状态就开始运行下一针样品，所以序列运行时第一针总是会有别于其他。于是我们增加了post time时间，保留时间恢复正常了。看来古语有训：欲速则不达，不无道理啊，照搬条件时还是应该考虑周到一点，更细心一点才是啊。
延迟效应导致的保留时间偏移

虽然有过几年使用质谱的经验，可是如此大规模的移植还是第一次，加上时间紧迫，考虑不周，移植过程中还发生过很多大大小小的有趣的故事，以上三个小插曲是让我感触最深的，贴出来跟大家分享一下，多多交流。

该帖子作者被版主新窦加 15积分， 2经验，加分理由：原创文章

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2011/7/8 20:53:25 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

不错的经验，投你一票了

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liumee

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2011/7/10 8:39:40 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

青霉素类标准品好像不太稳定，我们的青霉素G经常就走不出来了，楼主有没有碰到类似情况？

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coffee8

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2011/7/10 8:53:47 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

为什么不同的仪器会有不同的峰
至于容易出现加钠？加氢？加氨，还是加钾峰？
这些与什么有关系呢？

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happy爱米粒

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2011/7/10 16:43:03 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

形成不同的分子离子峰可能除了跟化合物本身的性质有关，还与液相系统有一定的关系，因为是新买的液相，管路和试剂瓶中都会有一定钠、钾离子的存在，而premier液相系统相对使用时间较长，再加上流动相中使用了乙酸铵，抑制了加钠峰的形成。另，加钠、加钾峰太过稳定，不易碎裂，若碰撞能量过高，又会完全碎裂成小离子峰，所以能选择加氢峰、加铵峰的时候就不选择加钠峰，当然前提是要满足灵敏度的需要。

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