摘要 [目的]建立一种测定牛奶和奶粉中保泰松残留的液相色谱-串联质谱法测定方法。[方法]用乙醇、氨水提取，乙醚、石油醚分离脂肪，酸化四氢呋喃-正己烷萃取，流动相定容、外标法定量。[结果]回收率86.0％～96.1％，室内四个水平相对标准偏差均在10.63%以内，重复性相对标准偏差（RSDr）在3.34%～3.99%之间，再现性相对标准偏差（RSDR）在6.96%～10.34%之间。在0.03 ng～6 ng范围内均呈线性关系，检出限（LOD）为1.0 μg/kg。[结论] 方法准确、简便，可以应用于牛奶和奶粉中保泰松残留量的测定。

保泰松（Phenylbutazone），又名苯丁唑啉、4-丁基-1，2-二苯基-3，5-吡咯烷二酮、布他酮、布他唑立丁、布泰其安。化学名称：3，5-Pyrazolidinedione，苯基丁氮酮，为吡唑酮类衍生物。RTECS编号：UQ8225000，CAS登记号：50-33-9。分子式：C₁₉H₂₀N₂O₂，分子量308．41。白色或类白色结晶性粉末，易溶于丙酮；氯仿或苯，溶于乙醇或乙醚，几乎不溶于水，溶于氢氧化钠溶液。无臭，味略苦。具有解热镇痛、抗炎及抗风湿作用，主要用于治疗风湿性，类风湿性关节炎及痛风。

由于抗炎抗风湿作用强，曾广泛用于人类的治疗。但代谢产物(Oxyphenbutazone)有不良反应^[1]，引起肝炎^[2～4]、中毒甚至致死^[5～9]等。在兽药和饲料添加剂中使用，不可避免地造成动物产品中该药物的残留。因此，建立一种与世界发达国家同一水平的牛奶和奶粉中保泰松残留检测方法，对提高我国食品安全与卫生质量、保护国民的健康、促进动物产品出口是十分必要的。

目前检验方法主要有HPLC法^[10～15］、气相色谱法^[16，17]、紫外法[18]毛细管电泳法^［19,20］和电化学检测方法^[21]。文献报道的测定保泰松分析方法多应用于药品中和畜禽中^[10～21]，未检索到可应用于牛奶和奶粉中保泰松残留量的资料。本文主要参考AOAC建立的分析方法^[9]，重新优化了提取体系和测定条件，建立了碱性去除脂肪、酸性条件下提取牛奶和奶粉中的保泰松、液相色谱-串联质谱法检测、外标方法定量测定保泰松的新方法。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪器

美国应用生物系统公司AB 3200 Q TRAP液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾离子源），天平（感量0.01 g，0.000 1 g），漩涡混合器，氮气浓缩仪，10 mL具塞聚丙烯离心管，离心机（2600 g），超声波清洗仪，振荡器。

1.1.2 试剂

除另有说明外，所用试剂均为AR级。水：GB/T 6682，一级。甲醇，乙醇，乙醚，石油醚，乙酸乙酯，盐酸，甲酸铵。氨水，CP。四氢呋喃，正己烷，乙腈，HPLC级。二硫苏糖醇（dithiothreitol。CAS：3483-12-3）：C₄H₁₀O₂S₂，纯度≥99%。N，N-二甲基甲酰胺（CAS：68-12-2，含量99.5%）。稳定液：0.25 mg/mL二硫苏糖醇-乙酸乙酯溶液（125mg二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol）溶于乙酸乙脂并定容至500ml）。0.05 mol/L醋酸铵（1.95g醋酸铵溶于500ml水中，过0.2μm的水相滤膜。使用前过滤）。

保泰松标准储备溶液：称取适量保泰松标准物质（CAS：50-33-9，纯度≥95%），用80 mL甲醇溶解，加入5mL稳定液，用甲醇定容于100 mL容量瓶中。同时，根据不同测定需要，稀释适当浓度的保泰松标准应用溶液。

1.2 仪器工作条件

2.1 试验方法

2.1.1 样品分析

牛奶：称取1 g试样，精确至0.01 g，置于10 mL具塞聚丙烯离心管中，加入1.0 mL乙醇混匀；加入0.1 mL氨水，混匀；加入2.5 mL乙醚，于漩涡混合器混匀20 s，静置5 min；加入2.5 mL石油醚，于漩涡混合器混匀20 s，静置5 min。小心吸弃上清液，依次加入5 mL四氢呋喃-正己烷混合溶液和0.4 mL 3.0 mol/L盐酸，于振荡器上剧烈振荡30 min。在2600g离心力下离心10 min后，小心吸取上清液于另一10 mL离心管中，用氮气浓缩仪于50℃水浴中吹至近干。准确加入1000 μl N，N-二甲基甲酰胺-甲酸铵混合溶液（1+49），于超声波仪中助溶，残渣溶解后，过0.2 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

奶粉：按照1 g奶粉加水8 mL的比例，将奶粉溶解为还原奶后，按照牛奶的提取步骤进行。

同时提取基质空白溶液。

2.1.2工作曲线绘制

在标准工作系列溶液中分别加入20 μl/ml N，N-2-甲基-甲酰胺和相应浓度的保泰松溶液，用基质空白溶液定容为0、15.0 ng/ml、30.0 ng/ml、60.0 ng/ml、150.0 ng/ml保泰松基质标准工作系列。在仪器最佳工作条件下，以基质混合标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中保泰松的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，保泰松的参考保留时间5.46 min.

2.2 质谱仪器条件的优化

2.2.1 液相色谱条件：

色谱柱（Intersil C₁₈，150 mm×2.1 mm，3 μm），进样量30 µL，流速0.2 mL/min，柱温40 ºC，流动相A（0.01 mol/L甲酸铵溶液），流动相B为乙腈，洗脱条件（恒配比A:63%+B:37%），流速0.20 mL/min，时间10.0min。

2.2.2 质谱条件

优化后的质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描，多反应检测，电喷雾电压500V，雾化气压力0.069MPa，辅助气流速0.414 L/min，离子源温度500℃，碰撞室出口电压32V，定性离子对(m/z)为309/160和309/146、定量离子对(m/z)为309/160、碰撞气能量31 V/30V和去簇电压31 V。

3 结果与讨论

3.1 提取溶液的选择

根据相关文献资料，试验了文献^{[12，13，14]}、氯仿、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、正己烷、乙醚等提取试剂，并且对此进行了对比实验。回收率分别为文献^[10，11] 138%、氯仿102%～115%、乙腈61.7%、丙酮37.2%、乙酸乙酯21.0%、甲醇5.3%、正己烷33.6%、乙醚15.3%，文献^[12]回收率在102%～115%范围。所以本方法采用文献^[12]规定的试剂作为提取液。

3.2 各步骤的反应现象和对回收率的影响

根据文献资料^[12]，我们对牛奶中提取保泰松的各试剂对回收率的影响进行了对比实验，实验结果见表1。

表1．不同步骤对提取效果的影响回收率（添加水平50 μk/kg）

从表中数据可以看出，对于1 ml样品来说，不加入乙醇时，在下一步加入氨水后，全部呈乳白色凝胶状态，实验无法进行，加入1.0 ml可以保证满意的回收率，选择加入1 ml乙醇。

不加入氨水的样品在离心后都没有沉淀析出，氨水加入量在0.05 ml～0.1 ml的回收率都是令人满意，超过0.2 ml的回收率无法接收。建议加入量在0.1 ml，因为液态的牛奶在环境中容易被发酵，PH值下降，所以，在可以接受的范围内，适当增加氨水用量，有利于保证碱性条件下的去除油脂等杂质的影响，但是超过这个数值，结果难以接收。分析应该是在酸性提取步骤，没有足够的酸去中和过量的碱，无法保持样液的PH值小于7。选择加入0.1 ml 25%的氨水。

如果不加入乙醚，回收率在69.3%，分别加入2.5、4.0 ml，发现2.5 ml的回收率最高；当不加入石油醚时，回收率在55.2%，在加入1.0、2.5ml时的回收率分别为82.2%、97.2%，但是加入4.0 ml后，回收率反倒下降为76.5%；选择乙醚和石油醚的加入量都为2.5 ml。

在酸性去蛋白和提取过程中，如果不加入四氢呋喃—正己烷混合液，正常离心条件下，则无上清液，而分别不同加入不同量，以5.0 ml最高。选择加入5 ml四氢呋喃—正己烷混合液。

不加入3 M盐酸样品中，无白色沉淀，回收率测不到；在酸性条件下，都产生白色条絮状沉淀，但是回收率以加入量为0.4 ml为最高。选择加入3 M盐酸量为0.4 ml。

3.3 样液浓缩、定容过程各因素对回收率的影响

文献^[13]方法已经证明，样液蒸干后，保泰松的回收率远远低于蒸至近干的的回收率。在实验中发现，在55℃水浴中浓缩样液的浓缩程度对回收率的影响很大，结果见表2。

表2．样品在不同浓缩条件和助溶条件对回收率的影响（添加水平50 μk/kg）

在本试验中，定容溶解时，如果不经过超声波助溶，保泰松的回收率远远低于蒸至近干的的回收率；加入2%的DMF助溶剂，回收率效果远远高于不加入DMF助溶剂的样品回收率。因此，本方法在样液浓缩和定容过程中采用蒸至近干、加入2%的DMF助溶剂和超声波助溶的方法。

3.4 振荡和离心条件对回收率的影响

文献^[12]采用的是振荡30mim后，1100g离心30min。考虑到需要提高实验效率，对此进行了比对实验。实验结果见表3。

表3．离心条件对回收率的影响（添加水平50 μk/kg）

离心时间（min）离心力（g）回收率%

10 1100 29.420 1100 82.330 1100 87.110 2640 82.020 2640 87.6

数据显示，在1100 g离心力条件下，离心20min和离心30 min的回收率在80%以上；在2640 g的离心条件下，10min 的效果与在1100 g离心力条件下、离心20min 的效果相当。所以，本方法采用的离心条件为2640 g离心力下离心10 min。

3.5 内标方法与外标方法的选择

在文献^{[10，13～21]}中都采用外标方法，文献^[12]采用的是DL-二氯酚酸钠作为保泰松的内标方法，但是对牛奶的检测没有涉及。对此进行了比对实验，实验结果见表4。

表4．内标方法与外标方法的回收率（添加水平50 μk/kg）

从表中数据可以看出，对于相同样品的相同测定数据处理，内标方法和外标方法的处理结果相差很大。在本方法的4个平行样品测定结果，内标方法的回收率的平均值为116.15%，高于外标方法的108.25%；内标方法的变异系数(SD%)为13.99%，高于外标方法的4.97%；内标方法的标准偏差(RSD%)为16.25%，高于外标方法的5.38%。同时，考虑到加入内标会增加影响因素和操作的简化需要，所以采用外标方法。

4 线性范围和测定低限

根据保泰松的灵敏度，用样品空白溶液配成系列质基标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，进样量为30 μL，用峰面积对基质标准工作溶液中被测组分的浓度作图。线性范围5.0µg/kg～200.0µg/kg，线性方程Y=11200X―3620和线性相关系数r0.9991。

该方法操作条件下，保泰松在添加水平1.0 µg/kg～200 µg/kg范围时，响应值在仪器线性范围之内，保泰松的绝对量在0.03 ng～6 ng范围内均呈线性关系。以峰高的信噪比S/N大于5来确定方法的最小检出限，根据最终样液所代表的试样量，定容体积，进样量和进行测定时所受的干扰情况，确定本方法保泰松的最小检出限（LOD）为1.0 μg/kg。保泰松基质标准LOQ（a）、基质标准LOQ添加（b）和空白样品(c)检测多反应检测(MRM)图见图1。

图1. 保泰松基质标准LOQ（a）、基质标准LOQ添加（b）和空白样品(c)检测多反应检测(MRM)图

5方法的回收率和精密度

用阴性牛奶样品进行添加回收和精密度实验，样品中分别添加5.0 µg/kg（第一水平）、10.0 µg/kg（第二水平）、20.0 µg/kg（第三水平）、50.0 µg/kg（第四水平）不同浓度标准后，摇匀，使标准样品充分吸收，然后按本方法进行提取、净化、测定，其回收率和精密度见表5。从表5中的回收率及精密度数据可以看出，本方法回收率数据全部在88.43%～94.72%之间，室内四个水平相对标准偏差均在10.63%以内，说明方法的回收率和精密度良好。

表5．保泰松添加回收率与精密度实验（µg/kg）

6 方法的适用性

我们采用本方法对有代表性的牛奶、脱脂奶粉、全脂奶粉和全脂加糖奶粉，在5.0 µg/kg、10.0 µg/kg、20.0 µg/kg、50.0 µg/kg四个添加水平，对保泰松进行添加回收率实验，其分析结果见表6。在保泰松出峰区域未见干扰峰，样品的回收率在86.0％～96.1％之间，所做空白样品实验也表明，对于牛奶、脱脂奶粉、全脂奶粉和全脂加糖奶粉等样品，本方法的适用性很好。

表6．方法的适用性添加回收率（%，n=10）

7 方法的实验室间验证结果

本方法经8个实验室进行重复性和再现性验证。用不含保泰松的牛奶样品分别做5.0 µg/kg、10.0 µg/kg、20.0 µg/kg、50.0 µg/kg四个水平的添加实验，添加验证结果见表7。

表7． 8个实验室添加验证实验统计表（μg/kg，回收率%）

验证单位第一水平第二水平第三水平第四水平

1 4.40 10.1 19.7 48.0 4.68 9.19 19.5 46.12 4.44 9.19 19.0 45.5 4.13 9.21 17.9 47.63 4.55 8.21 17.9 41.5 4.67 7.74 16.2 39.44 3.81 7.82 16.3 47.7 4.01 7.92 15.1 45.05 5.06 8.71 15.4 44.7 5.37 8.72 15.9 43.16 4.43 9.75 16.6 50.4 4.35 9.42 16.9 47.97 4.82 10.1 18.7 44.0 5.14 9.7 18.6 41.48 3.93 9.5 16.4 40.9 4.07 9.87 16.2 44.9m 4.49 9.07 17.27 44.88RSDr（%） 3.75 3.34 3.54 3.99RSDR（%） 10.34 9.10 8.86 6.96r-m回归方程 lg r=1.0367 lg m-1.0325R-m回归方程 lg R=0.8361 lg m-0.4276

按照国家标准GB/T 6379《测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性》进行精密度数据统计，全部实验数据经格拉布斯（Grubbs）法、科克伦（Cochran）法、狄克逊（Dixon）法检验未发现异常值。保泰松重复性相对标准偏差（RSD_r）在3.34%～3.99%之间，保泰松再现性相对标准偏差（RSD_R）在6.96%～10.34%之间，均符合国际AOAC标准分析方法对国际协同研究实验室内与实验室间重复性相对标准偏差和再现性相对标准偏差之要求。

本方法在参考AOAC^[12]检测方法并作了改进和验证，回收率稳定，改善检出限，牛奶的方法检出限达到1.0 μg/kg，奶粉的方法检出限达到8.0 μg/kg。适合牛奶和奶粉中保泰松残留的测定。

8 参考文献：

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