主题：【分享】细胞分离密度梯度离心原理

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发表于：2011/08/04 14:46:54 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

自从1977 年推出以来，二氧化硅胶体Percoll^TM已经成为全世界数以千计的研究人员对密度梯度介质的选择。其近乎完美的物理特征方便它在细胞、细胞器、病毒和其他亚细胞颗粒分离中的使用。Percoll做为第一步在进行更高分辨率分离或核酸抽提前富集细胞是非常有用的。人们会认识到在进行其他的这些方法前使用
Percoll 做为第一步可以节省大量的时间和资源。
对于生物学颗粒，理想的梯度培养基被描述为具有以下特征:

涵盖了足够的对于所有感兴趣的生物颗粒的恒定密度(图1) 带范围
拥有生理离子强度和pH
在全部梯度中是等渗的
低粘度
无毒性
不会渗透生物膜
无菌且可以重复灭菌
在适度的离心力下将自动形成梯度
和生物材料相容
很容易从被纯化的材料中去除
不影响分析程序

不会猝灭放射性分析

Percoll在现有的介质中是非常特殊的，它符合上述所有的标准，并且提供以下附加的优点：

它能形成连续梯度和不连续的两种梯度。
梯度的稳定性意味着梯度可以预制以提供可重复性的结果。
使用带颜色的Density Marker Beads进行梯度分析十分简单(GE Healthcare提供)。
Percoll 不影响被分离的材料进一步的研究。
数以千计的研究人员的成功已经记录在Percoll Reference List 中。

密度梯度离心原理
当颗粒悬浮液被离心时，颗粒的沉降速率和应用的离心力是成比例的。溶液的物理性质也会影响沉降速率。在一个固定的离心力和液体粘度下，沉降速率和颗粒大小以及它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。
在一个离心范围中一个球体的沉降方程为：

这里v = 沉降速率
d = 颗粒直径(流体力学等效球体)
pp= 颗粒密度
p1 = 液体密度
h= 介质粘度
g = 离心力
从这个方程中，可以观察到下列关系：

颗粒沉降速率和它的大小成比例。
沉降速率和它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。
当颗粒密度等于周围培养基密度时，沉降速率为0。
沉降速率随着介质粘度的增加而降低。
沉降速率随着离心力的增加而增加。

通过密度分离
(等密度离心法)
在这个技术中，梯度介质的密度范围包含了样品颗粒的所有密度。每种颗粒将沉降到梯度中的平衡位置，在这个位置梯度密度等于颗粒密度(等密度位置)。因此，在此类分离中，颗粒基于不同的密度而被单独分离，与颗粒大小无关。

图1显示两种类型的梯度分离(见下面的速率区带离心法)。当使用Percoll时，普遍是等密度分离颗粒而不是根据颗粒的大小差别(仅见31 页的图19，两种技术都使用)。
注释: 当考虑生物学颗粒时，切记介质的渗透压能够明显地改变膜结合颗粒的大小和表观浮力密度。一个高的渗透压能够导致膜结合颗粒收缩而培养基低的渗透压将导致结合颗粒的膨胀。

图2 显示在生理条件下( 280 到320mOsm/kg H2O) 使用Percoll梯度离心的颗粒比用蔗糖或甲泛葡胺离心的颗粒有低得多的表观浮力密度

通过大小分离(速率区带离心法)
在这类技术中，颗粒之间的大小差别与颗粒的密度一起影响分离。正如上述的方程所示，大颗在整个梯度中比小颗粒移动更快，因此选择密度范围以便在整个分离期间的所有的位置上的颗粒密度大于介质密度(图1)。被分离的区带到达管底部(或者它们的平衡位置) 之前运行被终止。

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