主题：【讨论】【弱智级请教】色谱柱固定相是怎么起到对应作用的

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C18色谱柱是以硅烷化键合型(Si-O-Si-C)存在的，这类键合反应目前应用最为普遍。如以十八烷基三氯硅烷与全多孔型硅胶M-Porasil-C18反应生成烷基化学键合相，商品名为M-Bondapak-C18。

我是经常看到C18，C8之类的，有点明白了。多谢讲解。分离的时候，这种要把键断开，是加热断开吗？

好像不断开吧，他们都是反相柱，你看看反相柱原理吧。反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大，对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(强)．溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80Å)的表面积约为250m/g，而300Å孔径载体的比表面积约为60m/g。当其他条件相同时，溶质在300Å孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80Å孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于强亲水性样品洗脱．样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度．在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低保留值．固定相的不同也可以导致选择性发生变化，氰基、苯基、C8、C18等柱的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱．

　　反相条件下，大多数蛋白质由于低PH、有机溶剂存在、温度高于室温和疏水键合相等综合原因发生变性，这些化合物可能以两种或两种以上独立或动态平衡的形式存在，它们通过色谱柱的保留速度不同，导致谱峰展宽、变形、甚至出现单一蛋白有多个峰的现象，部分变性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脱蛋白的回收率低和鬼峰．反相色谱固定相表面烷基链长度对蛋白质的反相保留和蛋白质的活性回收有很大差异，烷基链越长(C8、C22、C30)，固定相疏水性越强，为使蛋白质等生物分子洗脱，流动相合机溶剂的含量较高，疏水性过强，会导致生物分子的不可逆吸附和生物活性损失，因此短链烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分离中表现出优势。对多数小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色谱柱分离，使蛋白完全展开并避免聚集或沉淀，能够得到理想的分离结果。

yifan 同学回复的很快呀，是在学雷锋吗
绝对是雷锋级的，俺还不知道他的名字呢，然而指点很多，显然我师！

可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。
yifan 同学回复的很快呀，是在学雷锋吗哈哈，不是为了帮助而帮助。答复别人时，自己也可以再学习一下。
沾光一起来学习

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yifan 同学回复的很快呀，是在学雷锋吗

绝对是雷锋级的，俺还不知道他的名字呢，然而指点很多，显然我师！一起学习，共同探讨。

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yifan 同学回复的很快呀，是在学雷锋吗

绝对是雷锋级的，俺还不知道他的名字呢，然而指点很多，显然我师！

一起学习，共同探讨。
向雷锋学习，我也收获不少

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硅胶柱层析的固定相就是硅胶了吧？！

是的

版主出现总是那么及时！
那么不需要再涂固定液了吗？！

应该不需要了。硅胶柱层析惯用方法　　1.称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。

　　2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

　　3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。

　　4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

　　5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

　　6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。

　　7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂低1-2个数量级。

　　8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

每次都要这么干吗？那不是很麻烦

我是经常看到C18，C8之类的，有点明白了。多谢讲解。分离的时候，这种要把键断开，是加热断开吗？好像不断开吧，他们都是反相柱，你看看反相柱原理吧。反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大，对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(强)．溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80Å)的表面积约为250m/g，而300Å孔径载体的比表面积约为60m/g。当其他条件相同时，溶质在300Å孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80Å孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于强亲水性样品洗脱．样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度．在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低保留值．固定相的不同也可以导致选择性发生变化，氰基、苯基、C8、C18等柱的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱．

　　反相条件下，大多数蛋白质由于低PH、有机溶剂存在、温度高于室温和疏水键合相等综合原因发生变性，这些化合物可能以两种或两种以上独立或动态平衡的形式存在，它们通过色谱柱的保留速度不同，导致谱峰展宽、变形、甚至出现单一蛋白有多个峰的现象，部分变性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脱蛋白的回收率低和鬼峰．反相色谱固定相表面烷基链长度对蛋白质的反相保留和蛋白质的活性回收有很大差异，烷基链越长(C8、C22、C30)，固定相疏水性越强，为使蛋白质等生物分子洗脱，流动相合机溶剂的含量较高，疏水性过强，会导致生物分子的不可逆吸附和生物活性损失，因此短链烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分离中表现出优势。对多数小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色谱柱分离，使蛋白完全展开并避免聚集或沉淀，能够得到理想的分离结果。
我还有一个误解。化学键合，我还以为固定相通过化学键与样品物质结合呢！
固定相与样品还是溶解、释放这么个物理过程。
化学键合相，完全是固定相内部的结合方式。
又明白一点了

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原文由 jjwws(jjwws) 发表:
yifan 同学回复的很快呀，是在学雷锋吗

绝对是雷锋级的，俺还不知道他的名字呢，然而指点很多，显然我师！

一起学习，共同探讨。
您太客气了。我正认真学习您的指教，尊重您的学识和劳动！

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硅胶柱层析的固定相就是硅胶了吧？！

是的

C18固定相是不是在硅胶上再嫁接18个碳的物质？18个碳的物质是什么呢？

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硅胶柱层析的固定相就是硅胶了吧？！

是的

C18固定相是不是在硅胶上再嫁接18个碳的物质？18个碳的物质是什么呢？

十八烷基