1.2. 2-△△CT方法的假设和应用 要使△△CT计算方法有效,目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物△CT如何变化。 图1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。对于每一个稀释样本,都用GAPDH 和c-myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。计算出c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以及△CT值,通过cDNA 浓度梯度的log值对△CT值作图,如果所得直线斜率绝对值接近于0,说明目标基因和内标基因的扩增效率相同,就可以通过△△CT方法进行相对定量。在图1中,直线斜率是0.047,因而假设成立,△△CT方法可以用来分析数据。如果两个扩增反应效率不同,则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量;或者也可以重新设计引物,优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。 1.3. 2-△△CT内标和参照因子的选择 使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的RNA 进行均一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时 PCR 反应内标基因包括GAPDH,β -actin,β2-microglobulin 以及rRNA 。当然,其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在2.2 部分有描述。 2-△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子(calibrator )。经内标基因均一化处理後,通过方法计算,目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样,△△CT=0,而20=1。所以根据定义,未处理样本的倍数变化为1 。而对于那些经过处理的样本,相对于参考因子基因表达的倍数为2-△△CT。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异,在这种情况下,一般选0 时刻的样本作为参照因子。 有些情况下,并不是比较不同处理样本基因表达差异。例如,有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。在这种情况下,参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。表1显示了大脑和肾脏总RNA 中c-myc 和GAPDH 转录本的CT 值。在这一个例子中,大脑被人为的选择为参照因子,通过计算得到肾脏c-myc 表达量经GAPDH 校正後相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较,但结果的生物学解释是相当复杂的。不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。 |