快速导航采购仪器提醒

PCR

版主:

入住本版

专家:

仪器信息网

居民列表

仪器社区 > 生命科学仪器 > PCR 帖子详情

快速回复发表新帖最新帖

返回列表

主题：【资料】甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施

浏览0 回复2 电梯直达

省部重点实验室

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

发表于：2012/03/03 09:55:02 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：

（1）亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0-3.9mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5.0；

（2）修饰时间应掌握在10-16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；

（3）反应温度应控制在50-55℃（若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好）；

（4）DNA模板量应控制在<2ug为宜。

只要遵循以上几点基本上能保证99%未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96%已经降解 .当DNA样品较少时（如石蜡包埋组织、血清DNA），在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原（约1g）作为载体，有利于DNA沉淀（加入载体后轻轻晃动Eppendof管可见絮状DNA富集现象）。

甲基化特异PCR可能出现的问题与对策

1.引物因素分析MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。

MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同，MSP的引物设计原理是：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5-端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5-端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C-U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR扩增。MSP的引物序列中至少含有1个以上CpG位点，最好是含有多个CpG位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA序列设计，同时也应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP引物，可用在线MethPrimer软件在线设计引物，网址为http://www.urogene.org/methprimer/index1.html.根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5.0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率<30% 的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。

2.MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260/A280在1.8-2.0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败；而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。Mg“浓度一般在2.0-2.5 mmol/L为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR的缓冲液及Taq酶的来源也很重要，一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的Taq酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka-ra公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRa IATaq with gc Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq酶后，不要轻易更换，以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。

3.MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况：

（1）产物电泳为阴性；

（2）产物电泳出现多条非特异性条带（含目的基因条带）；

（3）产物电泳为阳性（仅目的基因条带）。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR反应中，Tm的高低与CG含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR偏性。我们建议，提高预变性温度（一般应>95.C，10 min）和变性温度（>95℃ ，1min），退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。

总之，在MSP全过程中，影响结果的因素较普通PCR要多得多，只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP的准确度和精密度。

0
赞贴
2
回帖
0
收藏
0
拍砖
版主
招募

为您推荐

近期热榜

热门活动

您可能想找: PCR 询底价

选参数看心得找厂商查方案

专属顾问快速对接

立即提交

相关阅读

省部重点实验室

禁止发帖修改昵称

ID：gl19860312

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2012/3/3 9:55:21 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

qPCR中的P代表什么？Polymerase，聚合酶。如果qPCR少了聚合酶，你一定觉得这是在开玩笑，巧妇难为无米之炊，没有聚合酶，定量PCR还怎么做。

一直以来，研究人员在尝试创造自我复制的酶。实现这个目标的方法之一是用RNA酶来催化RNA分子的复制，包括RNA酶本身。这已经通过交叉催化（cross-catalytic）系统来实现了，它包括两个RNA酶，它们能利用四种底物成分来催化彼此的合成。

“R3C”就是一种能自我复制的RNA酶，但不是从核苷酸到核苷酸，而是通过碱基配对将两个RNA核苷酸连在一起。但是，这个过程效率很低，因为底物形成了无生产力的复合物，限制了指数级的增长，而倍增时间长达17小时。美国斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）的Gerald Joyce和他的同事就一直在研究并改进“R3C”连接酶。

他们将R3C转变成交叉催化的形式，在那里正链酶将两个RNA分子组合起来，产生非常相似的负链酶，这个负链酶反过来又连接两个底物，形成正链酶。随后，Joyce他们利用体外演化（in vitro evolution）来改善这种RNA酶的催化性质。在他们的努力下，当加入新鲜的寡核苷酸和镁离子之后，这些酶能够在42°C的恒温下以指数方式自我扩增，倍增时间缩短至1小时。

Joyce认为：“这种复制品的最大应用是它是分子事件的信号放大器。”他指的是将催化结构域和配体结合结构域（适体，aptamer）结合起来，产生“适酶（apatazyme）”，这样扩增就成为配体依赖型。在配体存在时，适体序列是有序的，“适酶”的催化结构域也是，从而实现了指数级的扩增。但是当缺乏适当的配体时，整个分子就变得不稳定，连接酶活性也丧失。RNA的指数增长率取决于配体的浓度，这就能确定样品中配体的浓度。这个过程与定量PCR是相似的，但是适用性更广。多种目标都受用，包括与诊断和环境监测相关的蛋白和小分子。

随着适体开发成为一种常规的方法，该系统能用于检测从蛋白到代谢物的所有分子。同时，研究人员也在对适酶系统进行改进，Joyce认为一年内倍增时间将缩短至10分钟。根据这种分子的动力学特性，他认为1分钟也是完全可行的。

赞贴

拍砖

省部重点实验室

禁止发帖修改昵称

ID：gl19860312

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2012/3/3 9:55:48 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

问：什么是QPCR？

答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实
时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。

问：QPCR、DNA检测、PCR之间的关系？

答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿：

第一代产品：

基因扩增热循环仪（DNA Thermal Cycler）+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂，构成PCR定性检测。

第二代产品：

基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂，构成PCR-DNA终点法定量检测（End-point quantitative PCR detection），又分为终点酶免定量（　End-point ELISA-PCR）和终点荧光定量（End-point Fluor-PCR）两种。

第三代产品：

实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂，构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。

问：相比以前的方法，QPCR有哪些特点？

答：QPCR至少有以下特点：

所用仪器少，只用一台仪器。

检测时间短，只须45分钟～1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须6～8小时，荧光终点定量须2～3小时。

操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。

结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化。

检测动态范围：10～10000000000 DNA copies/ml

检测精度：0.1RLU

辨别率：5000和10,000个模板拷贝样本的辨别率99.7％。

问：QPCR的技术先进性、价格及应用现状？

答：实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：

HBV乙肝病毒DNA，HCV丙肝病毒RNA，HIV艾滋病病毒RNA，Chlamydi trachomatis（CT），性传播疾病，沙眼衣原体，Neiserria gonorrhea(NG)，性传播疾病，淋病双球菌，Cytomegalovirus（CMV），性传播疾病，巨细胞病毒，Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，结核分支杆菌等。

实时荧光PCR仪研发技术难度大，门槛高，发达国家也只有有限几家知名公司生产，且售价昂贵：如
美国ABI/7700-120万元，美国ABI/5700-50万元，瑞士Roche/Lightcycler-70万元，美国Stratagene公司2005年新品MX3005P-80万元

可见，在病人看来，哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征，在发达国家也是如此。

国产仪器情况：国产仪器生产单位不超过五家，其中包括：

日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪（33孔）

西安天隆科技有限公司TL988实时荧光QPCR仪（48孔）

以上产品均取得国家SFDA认证，报价均在45万以上。

国产试剂情况：

多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒，价格与终点法试剂相当，且品种齐全，价格便宜，购买方便：
乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病双球菌NG、沙眼衣原体CT、解脲支原体UU、疱疹病毒HSV、人体乳头瘤HPV，优生优育系列：巨细胞病毒CMV、弓形虫COX等。

赞贴

拍砖