1、安全要求

操作时穿工作服、戴口罩和手套，提取、净化和浓缩时在通风橱中进行，避免溶液、气体吸入和皮肤接触，废液和废渣分别倒入专用容器中，按要求处理。

2、急救措施

皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗，有机溶剂或酸、碱溅入眼中用清水冲洗。

3、适用范围

该标准操作规程适用于鱼、虾可食部分中己烯雌酚残留量的测定。

4、检测原理

以乙酸乙酯提取样品中的己烯雌酚，固相萃取柱净化，硅烷化试剂衍生化后，用气相色谱-质谱仪测定，外标法定量。

5、仪器设备

5.1 气相色谱质谱联用仪：配备电子电离（EI）离子源。

5.2 分析天平：感量0.000 01 g。

5.3 旋涡混合器。

5.4 高速冷冻离心机。

5.5 氮吹仪。

5.6 旋转蒸发仪。

5.7 固相萃取装置。

5.8 具塞玻璃离心管：10 mL。

5.9 SLH固相萃取柱：500 mg，6 mL。

5.10 样品反应瓶：2 mL，去活，螺纹口。

6、试剂和溶液

6.1 试验用水应符合GB/T 6682中一级水的规定。

6.2 己烯雌酚标准品：纯度≥ 99%。

6.3 乙酸乙酯：色谱纯。

6.4 甲醇：色谱纯。

6.5 正己烷：色谱纯。

6.6 无水碳酸钠：分析纯。

6.7 碳酸钠溶液：10%(W/V)，称取10 g无水碳酸钠，溶于100 mL水中。

6.8 己烯雌酚标准贮备液：准确称取己烯雌酚标准品0.010 g，用甲醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，即浓度为100 μg/mL的标准贮备液，置于-18℃冰箱中保存，有效期为6个月。

6.9 己烯雌酚标准工作液：临用前，准确吸取己烯雌酚标准贮备液，用甲醇稀释成浓度为0.005 μg/mL～0.25 μg/mL标准工作液。

6.10 衍生化试剂：N-O-双-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）/三甲基氯硅烷（TMCS）体积比99:1。

7、检测步骤

7.1 样品制备

7.1.1 鱼，去鳞、去内脏、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳、去内脏，取肌肉部分。样品均质，混匀。样品如不能及时检测，应-18℃以下冷冻保存。

7.1.2 取均质后的供试样品，作为供试试样。

7.1.3 取均质后的空白样品，作为空白试样。

7.1.4 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。

7.2 提取

称取5 g (精确到0.01 g) 样品于50 mL离心管中，加入碳酸钠溶液3 mL，乙酸乙酯20 mL，均质30 s，7 000 r/min离心10 min，移取乙酸乙酯层于100 mL梨形瓶中，残渣再加入10 mL乙酸乙酯，重复提取一次，合并乙酸乙酯层，于40℃旋转蒸发至干，用2 mL正己烷-乙酸乙酯（体积比为85:15）混合溶液溶解残留物，备用。

7.3 净化

依次用5 mL乙酸乙酯、5 mL正己烷活化SLH固相萃取柱，取备用液过柱，控制流速不超过2 mL/min，依次用2 mL正己烷，2 mL正己烷-乙酸乙酯（体积比为85:15）混合溶液淋洗小柱，弃淋洗液，将固相萃取柱抽干，用10 mL正己烷-乙酸乙酯（体积比为80:20）混合溶液洗脱，流速控制不超过2 mL/min，收集洗脱液于10 mL具塞玻璃离心管中，50℃水浴中氮气吹干。用1.0 mL乙酸乙酯溶解残留物，转移至样品反应瓶（5.10）中，氮气吹干。

7.4 衍生化

7.4.1 试样的衍生化

于反应瓶中加入100 μL衍生化试剂（6.10），盖紧塞子，旋涡混合30 s，80℃烘箱中衍生30 min，用氮气吹干。加入0.5 mL正己烷，漩涡混合10 s，供GC-MS分析。

7.4.2 标准溶液的衍生化

吸取一定量的己烯雌酚标准工作液于2 mL样品反应瓶中，氮气吹干，再按7.4.1操作。

7.5 测定

7.5.1 色谱条件

7.5.1.1 色谱柱：HP-5ms石英毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；或相当者；

7.5.1.2 载气：高纯氦气，纯度≥99.999%，流速1.0 mL/min；

7.5.1.3 进样口温度：250℃；

7.5.1.4 进样方式：无分流进样方式；

7.5.1.5 进样量：1 μL；

7.5.1.6 柱温：初始柱温150℃，以20℃/min，升至180℃，保持10 min，再以3℃/min升至230℃，保持4 min，再以30℃/min升到280℃保持2 min。

7.5.2 质谱条件

7.5.2.1 离子源：EI源；

7.5.2.2 离子源温度：230℃；

7.5.2.3 四极杆温度：150℃；

7.5.2.4 接口温度：280℃；

7.5.2.5 溶剂延迟：12 min；

7.5.2.6 选择离子监测（SIM）：己烯雌酚衍生物(m/z）：383、397、412、413。

7.5.3 气相色谱-质谱分析

7.5.3.1 定性方法

样品峰与标准物质的保留时间之差不大于0.10 min，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均应出现，要求样品峰的各选择离子相对强度与标准物质相应选择离子的相对强度之差不大于允许相对标准偏差（表1）。

表1 选择离子监测表

名称	监测离子/ m/z	相对强度/ %	允许相对偏差/ %
cis-DES衍生物	412	100	－
	413	37	± 15
	397	17	± 20
	383	17	± 20
trans-DES衍生物	412	100	－
	413	37	± 15
	397	17	± 20
	383	17	± 20

7.5.3.2 定量方法

以己烯雌酚衍生物定量离子（m/z 412）的峰面积单点或多点校准定量。当单点校准定量时根据样品溶液中己烯雌酚含量情况，选择峰面积相近的标准工作液进行定量，结果以cis-DES衍生物峰和trans -DES衍生物的峰面积之和进行计算，同时标准工作液和样品液中己烯雌酚响应值均应在仪器检测的线性范围之内。

7.6 空白试验

除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。

8、记录与计算

8.1 记录

8.1.1 原始记录

按农业部相关要求填写原始记录，原始记录中应包含样品编号、检测时间、执行标准、标准溶液浓度、计量器具编号、计算公式等信息，以便通过原始记录能够溯源。

8.1.2 打印图谱，谱图上应显示样品编号、测定组分峰面积或峰高、保留时间及测定组分名标识等信息。

8.2 计算

样品中己烯雌酚的含量按公式⑴计算。

X =[img=319,47]file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image002.gif[/img]………………………………… ⑴

式中：

X —— 样品中己烯雌酚含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C_S—— 标准工作溶液中己烯雌酚含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V —— 样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；

A_S1—— 标准工作溶液中cis-DES衍生物的峰面积；

A_S2—— 标准工作溶液中trans -DES衍生物的峰面积；

A₁—— 试样液中cis -DES衍生物的峰面积；

A₂—— 试样液中trans -DES衍生物的峰面积；

m —— 样品质量，单位为克（g）。

9、结果判定

9.1 回收率应满足70%～110%。

9.2 批内和批间相对标准偏差应满足≤15%。

9.3 己烯雌酚测定结果小于0.5 μg/kg时，为未检出。

10、注意事项

10.1 己烯雌酚具有顺反异构体，虽然药用己烯雌酚多为trans-DES，但在样品前处理过程中会产生一定量的cis-DES，且cis/trans比例会随前处理过程的不同而变化，为了更好地定量检测，结果以cis-DES衍生物峰和trans -DES衍生物的峰面积之和进行计算。

10.2 配制固相萃取净化所用的淋洗液和洗脱液时，应保证正己烷-乙酸乙酯的体积比准确。

11、附加说明

本操作规程按农业部第1163号公告-9-2009编写。